阿霉素肾病小鼠的肾脏病理转变过程

刘练，张高福，李秋，王墨

(重庆医科大学附属儿童医院肾脏免疫科、儿童发育疾病研究教育部重点实验室、儿科学重庆市重点实验室、重庆市儿童发育重大疾病诊治与预防国际科技合作基地，重庆400014)

阿霉素诱导的肾病模型，被认为能够较好的模拟人类微小病变和局灶性节段性肾小球硬化的肾脏病理改变［1］，长期以来，大部分实验的研究对象以大鼠为主，但对阿霉素肾病小鼠模型的报道却较少，并且实验周期较短［2，3］。本课题组在成功复制幼年大鼠阿霉素肾病模型的实验基础上，拟建立较长实验周期的阿霉素肾病小鼠模型，以期通过对不同时间点模型转变过程的研究获得稳定性好、可重复、与人体疾病契合度高的实验动物模型，为进一步的科学研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级雄性BALB/c 小鼠48 只，6 周龄，体重(21.79 ±1.41 )g，由重庆医科大学实验动物中心提供【SCXK(渝)2012-0001】，所有动物均饲养于重庆医科大学儿科研究所动物中心SPF 环境中【SYXK(渝)2012-0015】，自由饮水进食。

1.2 实验分组及模型建立

将小鼠随机分为对照组与模型组，对照组24只，模型组24 只。固定好小鼠，用75%酒精消毒鼠尾皮肤，模型组经尾静脉一次注射阿霉素(Pharmacia 公司，意大利)10.5 mg/kg，对照组注射等量的生理盐水。

1.3 标本的收集和检测

1.3.1 24 h 尿液的收集和检测

分别将小鼠置于代谢笼中，禁食不禁水，于实验的第0、2、4、6、8 和12 周收集小鼠24 h 全部尿液，5000 r/min×5min，离心，收集上清、分装，－20℃保存。

1.3.2 血标本的收集和检测

分别于实验周期的第4、8、12 周末，处死小鼠。10%水合氯醛(3mL/kg)腹腔注射麻醉小鼠后，经眼球静脉采血，全血在室温下自然凝固，待血清析出后，4000 r/min × 10 min，离心，分离血清，并于－20℃保存。全自动生化仪检测血清白蛋白、总胆固醇、低密度脂蛋白、肌酐。

1.3.3 肾组织的收集和检测

获得血标本后，用生理盐水对双侧肾脏进行原位灌洗，直至双肾发白，剥离肾脏包膜，称重。将双肾分别均分为3 等份，取左肾上下段1/3，放置于4%多聚甲醛中24 h，经脱水、石蜡包埋后制成肾脏病理标本，用于HE、PAS 染色;取右肾上段约1 mm3的肾皮质组织，用4℃2.5%戊二醛固定1 h，送重庆医科大学电镜室。

1.3.4 肾小球硬化指数(glomerulosclerosis index，GSI)的统计

肾组织石蜡切片，经HE、PAS 染色，光镜下根据肾小球毛细血管袢塌陷或消失、肾小囊断裂或纤维素样物渗出，半定量评价肾小球硬化程度，GSI 的统计方法［4］为:肾小球硬化程度根据肾小球硬化灶所占肾小球比例分为5 个等级，0 级:肾小球基本正常;1 级:肾小球硬化面积≤25%;2 级:25%＜肾小球硬化面积≤50%;3 级:50%＜肾小球硬化面积≤75%;4 级:肾小球硬化面积＞75%。根据每张切片肾小球平均硬化面积积分计算出GSI 表示肾小球硬化程度，公式为GSI=［(1 ×N1 +2 ×N2 +3 ×N3 +4×N4)/每张切片肾小球总数］×100%(N1 表示1级损害肾小球个数，… N4 表示4 级损害肾小球个数)。每一张切片选取10 个不重叠高倍视野并拍摄照片，统计分析10 张照片中肾小球硬化的情况。

1.4 统计学方法

所有数据均用SPSS 18.0 统计软件包进行统计分析处理。计量资料数据用(±s)表示，采用两独立样本t 检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 24 h 尿蛋白检测结果

实验2 周，模型组24 h 尿蛋白含量较正常组明显增高，持续至第12 周，第8 周时出现高峰(见表1)。

2.2 血清生化指标检测结果

与正常组相比，模型组于实验第4 周出现低蛋白血症，第8 周出现高脂血症，至12 周时，血清中肌酐明显高于正常组(见表2)。

表1 不同时期24 h 尿蛋白水平(n=8，±s，mg/24 h)Tab.1 Twenty-four-hour proteinuria levels in different periods

注:与对照组比较，* P＜0.05;与模型组第8 周比较，▲P＜0.05。Note:* P＜0.05，VS.Control group;▲P＜0.05，VS.The 8th week of model group.

时间(wk.)0 wk.2 wk.4 wk.6 wk.8 wk.12 wk.对照组Control0.50 ±0.120.46 ±0.220.45 ±0.290.67 ±0.380.48 ±0.240.37 ±0.25模型组Model0.49 ±0.21▲1.39 ±0.89＊▲1.52 ±0.61＊▲1.70 ±0.67*1.96 ±0.68*1.59 ±0.97＊▲

表2 不同时期血清生化指标检测(n=8，±s)Tab.2 Serum biochemical indexes in different periods

表2 不同时期血清生化指标检测(n=8，±s)Tab.2 Serum biochemical indexes in different periods

注:与对照组比较，* P＜0.05。Note:* P＜0.05，vs.control group.

组别Group时间Week白蛋白/g/L Albumin总胆固醇/mmol/L Total cholesterol低密度脂蛋白/mmol/L Low-density lipoprotein肌酐/μmol/L Creatinine 4wk32.87 ±1.502.92 ±0.380.35 ±0.104.33 ±3.06对照组Control8wk30.23 ±0.803.22 ±0.350.34 ±0.054.67 ±0.58 12wk29.38 ±0.722.93 ±0.400.34 ±0.015.50 ±1.29 4wk28.01 ±2.92*3.01 ±0.430.35 ±0.096.25 ±3.01模型组Model8wk26.70 ±0.81*4.59 ±1.14*0.44 ±0.05*5.60 ±0.89 12wk24.81 ±0.87*5.17 ±0.83*0.49 ±0.11*7.71 ±4.61*

2.3 不同时间点肾脏病理改变

2.3.1 肾脏HE 染色及PSA 染色检测结果

对照组小鼠在三个观测时间点HE 染色及PAS染色形态均正常(见图1.a-c，图2.a-c)。模型组小鼠第4 周时，HE 染色及PAS 染色可见肾小球血管袢与囊壁有轻度粘连，肾小球及肾小管形态基本正常;第8 周时HE 染色可见肾小球系膜细胞增生，系膜区扩大，肾小管管腔出现大量蛋白管型，肾间质炎性细胞浸润;第12 周时HE 染色可见部分肾小球萎缩，部分血管的血管腔缩小或闭塞，血管袢塌陷，系膜细胞增生，系膜区扩大，肾小管上皮细胞可见空泡样改变，部分管腔内有蛋白管型，伴肾间质炎性细胞大量浸润;PAS 染色显示部分肾小球有节段性玻璃样硬化(见图1.d-f，图2.d-f)(图1、2 见彩插1)。

2.3.2 肾脏透射电镜检测结果

对照组小鼠在三个观测时间点透射结果均无异常。模型组小鼠第4 周出现足突部分融合，内皮细胞及基底膜无改变;第8 周足突融合较前广泛;第12 周时足突广泛融合，肾小球基底膜局部明显增厚，系膜细胞增殖(见图3)。

2.4 肾小球硬化指数(GSI )

模型组第12 周GSI 为(2.81 ±0.84)%，明显高于同一观测时间点对照组GSI(0.33 ±0.21)%，差异均有统计学意义(P＜0.01)。

3 讨论

图3 各期肾脏电镜下改变Note:a.Control group;b.Model group(4 weeks);c.Model group(8 weeks);d.Model group(12 weeks)Fig.3 Morphological change in the renal tissues under transmission electron microscopy

阿霉素(adriamycin，ADR)是临床上常用的一种蒽环类广谱抗肿瘤药物，其建立鼠类肾病模型的主要作用机制包括三个方面:①通过细胞毒作用，直接损伤肾细胞，在DNA 水平干预足细胞蛋白的合成，造成足细胞的形态改变［5］;②在肾脏内的代谢产物与氧反应产生活性氧，诱发肾小球上皮细胞的脂质过氧化，导致滤过膜的结构和功能破坏［6］;③嵌入DNA 而抑制RNA 的合成，造成肾脏近曲小管上皮细胞含有DNA、RNA 的细胞器损伤［7］。

根据国外阿霉素肾病大鼠模型的实验报道［1、8］，在预实验中，我们设计给予BALB/c 小鼠9.0、10、10.5、11、11.5、12 mg/kg 共6 个阿霉素注射剂量，每个剂量组6 只小鼠，实验周期12 周，重点观察小鼠的死亡情况和肾脏病理改变，以期获得最适合的建立BALB/c 小鼠肾病模型的剂量。我们发现11 mg/kg 组、11.5 mg/kg 组、12 mg/kg 组实验至第12 周均出现部分死亡，死亡率分别为16.7%、33.3% 和66.7%。而9.0 mg/kg 组、10 mg/kg 组、10.5 g/kg组实验至第12 周均未出现死亡，但电镜扫描显示9.0 mg/kg 组和10 mg/kg 组实验至第8 周，肾脏足细胞足突仅有轻微融合;而10.5 mg/kg 组实验至第4 周时发现小鼠肾脏在光镜下无明显病理改变，电镜可见足突部分融合，符合人类微小病变型肾病的病理改变，第8 周时光镜下可见系膜细胞及基质增生，电镜显示足突广泛融合，但肾小球硬化不明显;第12 周时光镜可见肾小球局灶节段性硬化，伴肾小管空泡样变、炎症细胞浸润、肾间质损害，电镜发现足突广泛融合、肾小球基底膜局部增厚、系膜细胞增殖，这些改变均符合人类局灶性节段性肾小球硬化的病理特点。故本实验发现给予BALB/c 小鼠注射10.5 mg/kg 的阿霉素能较好模拟人类微小病变型肾病综合征和局灶性节段性肾小球硬化的病理改变。

儿童肾病综合征以微小病变型最常见［9］，大部分对激素敏感，部分对激素治疗依赖或者抵抗的患儿，5～10 年可转变为局灶性节段性肾小球硬化［10］，转变周期较成人长。在既往的实验中发现肾病大鼠发生硬化时间较早，6～8 周即出现了肾小球硬化［11］，而本实验中模型组小鼠在实验12 周时才发生局灶性节段性肾小球硬化，说明肾病小鼠发生硬化的时间比大鼠长，这提示小鼠肾病模型可能比大鼠更适合用于模拟儿童肾病综合征的发展过程。

作为一种常用的模拟人类微小病变肾病的经典动物模型，阿霉素肾病既往的动物选择主要是对阿霉素高度敏感的Wistar 大鼠、SD 大鼠，其模型特征迅速、持久、稳定［12］。但近年来研究发现，一些原发性肾病综合征的发病与足细胞相关蛋白编码的NPHS1、NPHS2、WT1 等基因突变有密切关系［13］，所以基因检测将成为研究肾病发病机制、判断预后的主要手段。由于小鼠有99%的基因跟人类相同，所有的器官和系统均跟人类相似，所以不论是从遗传学，还是病理生理学来看，小鼠和人类都具有高度同源性，并且小鼠模型在基因敲出、基因转染等技术开展方面已经比较成熟［14］。综上所述，无论是从作用时间、实验技术，建立阿霉素小鼠肾病模型，对进一步开展肾病发生发展机制的研究都有十分重要的意义［15］。

(本文图1、2 见彩插1 及封面)。

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