稀有鮈鲫对重铬酸钾和3，4－二氯苯胺急性毒性研究

张京佶，殷浩文，赵华清

(1.同济大学生命科学与技术学院，上海 200092;2.上海市检测中心生物与安全检测实验室，上海 201203)

许多化学品对环境和人体健康存在危害，通过标准化的毒性检测对其进行危害鉴别并实施管理是当今国际上新的趋势。OECD、ISO、USEPA 等组织机构关于化学品的毒性测试方法都涉及了鱼类［1－8］，同时为了实验数据的可靠性、可比性和通用性，这些方法也推荐了一些通用的实验鱼种，如:斑马鱼(Danio rerio)、黑头软口鲦(Pimephales promelas)以及日本青鳉(Oryzias latipes)等。

近年来，我国也陆续颁布了一些化学品鱼类毒性实验标准方法，但国内使用的实验鱼大多还局限于国际通用种。为了有效保护我国的生态环境和人体健康，同时也为我国化学品管理提供有力的技术支撑。目前，稀有鮈鲫作为标准实验鱼种的工作正在展开［9－14］，它也是目前被推荐实验用鱼中唯一的本土鱼种。

稀有鮈鲫(Gobiocypris rarus Ye et Fu)是我国长江上游的一种特有小型鱼类［15－16］。因其性成熟时间短，繁殖季节长，产卵量较大，在人工控制饲养条件下可常年繁殖，具有成为标准实验动物的潜能［15，17］。稀有鮈鲫的生物学特征研究已较为系统［18－21］，且在化学品测试和安全性评价、测试现场样品和污染指标、监测持久性污染物和内分泌干扰物等方面也有应用［22－25］，但生态毒理学应用研究还不够完善，尤其对标准化的化学品毒性测试结果的稳定性和可重复性验证研究数据缺乏。

我国化学品管理法规要求，鱼类急性毒性实验是必须在中国境内完成的测试项目之一［26］。通过实验可获得化学品对中国受试生物的急性毒性数据，并为后续毒性实验的设计和观察提供依据。同时，由于急性毒性实验时间短，易操作，实验条件便于控制且在国家管理体系中属于基础数据要求等特点，成为我国法规要求的生态毒性实验中应用频次最高的一种方法。

本文参考国内外标准方法，将稀有鮈鲫作为实验材料;优化筛选了国际上常用的两种参比化学品进行单一实验室内和6 个不同实验室间的重复实验，评价急性毒性实验结果的稳定性和可重复性。验证了稀有鮈鲫作为一种具有良好重现性的生态毒性测试用鱼种，具有成为标准实验动物的潜能。

1 材料与方法

在实验鱼种标准化研究中，生物测试体系的稳定性和可重复性是关键。因此，研究对实验生物、受试化学品、实验条件和方法以及实验设计等因素标准化后，进行多次单一实验室内和不同实验室间的鱼类急性毒性实验，从而评价稀有鮈鲫对化学品毒性效应的稳定性和可重复性。

1.1 实验生物

稀有鮈鲫由中国科学院水生生物研究所提供，为野生型封闭群(Ihb:IHB)。体长(3.0 ±1.0)cm。

1.2 受试化学品筛选

为能准确科学地评价实验结果的稳定性和可重复性，选择有代表性的化学品是关键。通常此类物质应具有纯度高、稳定性好、水溶性高、水溶液浓度稳定、对环境和研究者危害相对较小、易于准确分析等特点［27］。参考上述原则及国际上常用的参比化学品，优化筛选了无机物和有机物两大类各一个作为代表受试化学品。

重铬酸钾(potassium dichromate，Cr2K2O7，GR，上海国药集团化学试剂有限公司，批号F2009063)作为一种被国际上最广泛认可和推荐的参比化学品，是水生毒性实验中最常见的无机参比物。采用最常规的参比化学品进行重复实验，获得的结果更为可靠，也更具可比性。

3，4－二氯苯胺(3，4－dichloroaniline，C6H5Cl2N，98%，Alfa Aesar，批号10141038)是多种农药、医药、精细化工产品的重要中间体。作为除草剂的主要原料，广泛存在于环境中。由于其水溶性较低、毒性较大，实验过程相对复杂。但复杂实验条件下，考量鱼种效应的稳定性和可重复性会更有意义。

1.3 实验条件

实验用水为经活性炭过滤、紫外灭菌后曝气处理的自来水;pH 为6.0～8.5;硬度为0～250 mg CaCO3/L;实验温度为21～25℃;溶解氧浓度不低于空气饱和值的60%。光照周期为12 h－12 h;鱼的承载量小于1.0 g/L。实验采用静态方式暴露，实验周期为96 h。

1.4 实验方法

参考《OECD 化学品测试指南》［1］和《国家环保部化学品测试方法》［28］中鱼类急性毒性实验方法，分别进行重铬酸钾和3，4－二氯苯胺的实验室内重复实验和实验室间比对实验。

1.4.1 实验室内重复实验

重铬酸钾和3，4－二氯苯胺的暴露浓度分别为:50、85、145、250、425 mg/L 和2、3.6、6.5、12、21 mg/L。另设1 个空白对照;每个实验容器放入7 尾鱼，不设平行组。

重铬酸钾和3，4－二氯苯胺急性毒性实验在实验室内各重复18 次，其中每个化学品分3 次，每次6组完成。上述实验通过固定实验条件和方法，在不同时间、不同人员、不同个体受试生物条件下，总体分析和验证实验结果的稳定性。

1.4.2 实验室间比对实验的设计

参考国际上对生物验证研究的要求，选择重铬酸钾和3，4－二氯苯胺进行6 个实验室间的数据比对，进一步验证稀有鮈鲫急性毒性实验的重复性和稳定性。参与比对的实验室有:上海市检测中心(SAPM)、中国科学院水生生物研究所(IHB，共进行2 次比对实验)、南京环境科学研究所(NIES)、沈阳化工研究院安评中心(SYRICI)、华东师范大学(ECNU)、浙江大学农药与环境毒理研究所(IPETZJU)。

比对实验由本实验室确定实验方案，统一分发实验鱼和受试化学品，尽可能地减少系统误差的出现，相对保证了数据结果的可靠性和可比性。

1.5 数据处理

采用Trimmed S pearman－Karber 法计算96 h LC50(半数致死浓度)值。

1.6 有效性分析

实验期间，无论是实验室内还是实验室间，每个单独实验都满足方法本身的有效性。

所有实验用鱼均由中国科学院水生生物研究所提供，来源和品系明确，鱼体健康无污染。临实验前，所有实验鱼已在实验室驯养14 d 以上，驯养期间未发现疾病;实验开始前7 d 内死亡率小于5%。因此，实验用鱼满足方法要求，获得的数据相对可靠。

此外，所有毒性数据采用合适的统计方法计算后得出，结果具有一定的可比性。由此可见，本研究获得的数据科学有效。

2 结果

2.1 实验室内重复实验

暴露于高浓度重铬酸钾中的稀有鮈鲫表现为游动缓慢，身体多处发白，并逐渐溃烂，24 h 内大部分鱼死亡。18 次重复实验的96 h LC50值在105.24～288.43 mg/L 之间;变异系数＜35%。

暴露于高浓度3，4－二氯苯胺中的稀有鮈鲫表现为游动缓慢，个别实验鱼沉于实验容器底部，24 h内大部分鱼死亡。18 次重复实验的96 h LC50值在4.42～8.75 mg/L 之间;变异系数＜20%。

两种化学品急性毒性实验结果见表1。根据表1 的数据，按照USEPA［29］对数据质量控制的要求，两种化学品对稀有鮈鲫的96 h LC50值均在质量控制范围(¯x ±2 s)之内，稀有鮈鲫急性毒性实验在实验室内的稳定性良好。

表1 两种化学品对稀有鮈鲫的急性毒性(96 h LC50)Tab.1 Acute toxicity of the two chemicals to Gobiocypris rarus

2.2 实验室间比对实验

实验室间两种化学品对稀有鮈鲫急性毒性实验结果见表2。重铬酸钾和3，4－二氯苯胺的96 h LC50值分别在135.73～416.93 mg/L 和1.97～6.59 mg/L 之间;实验室间的变异系数分别为36.86%和41.21%。

根据表2 的数据，两种化学品对稀有鮈鲫的96 h LC50值均在¯x ±2s 之内，进一步证明了稀有鮈鲫急性毒性实验在实验室间的可重复性良好。

表2 实验室间两种化学品对稀有鮈鲫的急性毒性(96h LC50)Tab.2 Acute toxicity of the two chemicals to Gobiocypris rarus between different laboratories

3 讨论与结论

通过对数据的比较和分析发现，稀有鮈鲫急性毒性实验无论在实验室内还是在实验室间，都有着较好的稳定性和可重复性。实验室内重复实验验证显示，只要选择来源固定、年龄合适、健康状况良好的稀有鮈鲫;且暴露条件相对恒定，即使在不同人员、不同时间下进行实验，都就能获得较为稳定的实验结果。而实验室间比对实验验证显示，虽然各数据间离散程度(变异系数)相较于单一实验室内偏大，但也都在同一数量级;且根据新化学物质危害评估准则［29］中的化学品危害等级判定，数据上并无本质意义上的差别。因此，稀有鮈鲫急性毒性实验在不同实验室间的重复性也是可接受的。

通过标准化研究获得的批量数据可建立一个以统计学为基础的、行业可接受的质控区间。然后以此区间为参照，评估之后的其他单个实验或实验生物的可靠性。如:ISO(1996)［6］斑马鱼急性毒性实验中，将斑马鱼对重铬酸钾24 h LC50值范围控制在200～400 mg/L 之间以评估该批次斑马鱼的敏感性是否符合实验要求。根据USEPA(1985)［30］，一般为计算结果的平均值(¯x)及标准差(s)。将实验获得的结果计算2s，从第5 或第6 次数据后就可开始建立内部质量控制图，每次获得新数据后重新计算平均值(¯x)和上下质控限(±2s)，直至20 次，其后维持20 个数据点，去旧留新。本研究实验室内18次重复实验结果显示，稀有鮈鲫对重铬酸钾和3，4－二氯苯胺的96 h LC50值范围分别为105.24～288.43mg/L 和4.42～8.75mg/L;平均值(¯x)分别为182.30 mg/L 和6.59 mg/L;标准差(s)分别为56.31 mg/L 和1.15 mg/L。因此，可将两种化学品数据建立有效的稳定性和可重复性衡量数据库，形成一个可靠的稀有鮈鲫急性毒性范围，评估之后其他单个实验的可靠性。

随着实验动物科学的发展，有关鱼类实验动物的验证研究日渐活跃，毒性实验所用的材料鱼，除了要求个体小、实验室易饲养外，更趋向于拥有系统的、科学的标准化研究以验证其用于实验的可靠性，如国际上常用的斑马鱼(Danio rerio)、日本青鳉(Oryzias latipes［31］等。稀有鮈鲫是我国自行开发的水生实验动物，其标准化的验证研究国内外尚无报道。本研究通过我国本土的标准化的实验鱼种获得的生态毒性实验数据，对用于在遵从国际一致的标准化原则的前提下，科学地验证和评价稀有鮈鲫对化学品效应的稳定性和可重复性。做到了在使用中国特色鱼种的同时，遵循了国际通用的标准化验证研究过程，使稀有鮈鲫急性毒性实验对化学品的安全性评价更具说服力，同时也更易得到国际上的认可。

稀有鮈鲫作为一种具有潜力的生态毒性测试的生物种类，通过对鱼龄大小、暴露条件、方法等进行标准化的控制和固定，获得的急性毒性实验结果就有良好的稳定性和可重复性，适宜进行生态毒理学鱼类急性毒性实验的应用。但在实验动物标准化验证过程中，另有一些研究有待补充和完善，如稀有鮈鲫对化学品效应的敏感性、与国际通用鱼种数据间的可比性、鱼类慢性、长期实验数据的可靠性等。为能将稀有鮈鲫在生态毒理学中的推广应用，更多验证研究有待继续开展。

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