清胃散不同汤剂和颗粒剂中丹皮酚的含量变化分析

邵进明雷战霞王道平张明昶徐文芬麻秀萍*

（1贵阳中医学院，贵阳550002；2贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵阳550007）

清胃散不同汤剂和颗粒剂中丹皮酚的含量变化分析

邵进明1雷战霞1王道平2张明昶1徐文芬1麻秀萍1*

（1贵阳中医学院，贵阳550002；2贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵阳550007）

目的 考察丹皮酚在清胃散传统汤剂与配方汤剂以及清胃散颗粒剂和配方颗粒剂中的含量变化。方法 采用高效液相色谱法测定清胃散中丹皮酚的含量和气质联用技术分析方中的挥发油成分。结果 丹皮酚在清胃散传统汤剂与配方汤剂中的含量分别为0.12%、0.13%，而在合煎颗粒剂与分煎配方颗粒剂中均未检测出，同时气质联用技术检测其挥发油中丹皮酚的含量为88.7%。结论实验结果可对复方清胃散在临床上合理运用提供参考。

丹皮酚；清胃散；挥发油；高效液相色谱法；牡丹皮

宠清胃散出自李东垣《兰室秘藏》，具有清胃凉血之功效，主治胃火牙痛；临床上是指口腔炎、牙周炎、三叉神经痛等症状［1］，其有效成分为丹皮酚、阿魏酸、盐酸巴马汀和盐酸小檗碱等。而丹皮酚具有挥发性，可随水蒸气馏出［2］。它可能在煎煮、减压浓缩和干糙过程中随水蒸汽蒸馏而出，而病人在服药时是将中药复方汤剂趁热或放冷后喝下。现代药理实验表明丹皮酚具有非麻醉性镇痛、抗高血压、抗血栓形成、抗动脉粥样硬化和协同抗肿瘤等作用［3-5］。

本论文采用高效液相色谱法对清胃散不同汤剂和颗粒剂中丹皮酚进行含量测定分析，同时用气质联用技术分析该处方中的挥发油成分以探讨复方在煎煮、减压浓缩和干糙过程中丹皮酚的含量变化。

1 处方、仪器与试药

清胃散处方由黄连6g，当归6g，生地黄6g，牡丹皮9g，升麻9g组成，其中黄连为毛茛科黄连Coptischinensis Franch.根茎（四川），当归为伞形科当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels根（甘肃），生地黄为玄参科生地Rehmannia glutinosa Libosch.块根（河南），丹皮为毛茛科植物牡丹皮Paeouiasuffruicoat Andr．的干燥根皮（安徽），升麻为毛茛科Cimicifuga foetida L.根茎（贵州）。各药材经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定符合2010版《中国药典》收载标准。同时按照药典方法测定牡丹皮中丹皮酚的含量为1.36%，符合药典要求［6］。

LC-20AT型高效液相色谱仪、DAD检测器（日本岛津）；AG135型电子天平；CH-250型超声波清洗机；挥发油提取器等，甲醇为色谱纯，水为娃哈哈纯净水；提取溶剂甲醇为分析纯，水为蒸馏水。丹皮酚对照品（批号：11802-200504）购于中国药品生物制品检定所。

2 HPLC方法与结果

2.1 对照品及样品溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取丹皮酚对照品8.12mg，加甲醇定容至25mL。即得浓度为0.3248mg· mL-1的丹皮酚对照品溶液。

2.1.2 传统汤剂的制备 按实验处方称取药材饮片（合计36g），加8.5倍水［7］，浸泡30 min，头煎保持微沸20 min，倒出煎液；药渣再加4.5倍量的水煎煮15min，倒出煎液，合并所有药液，过滤并量好体积并用蒸馏水定容到500mL，密封待用。用0.45μm微孔滤膜过滤即得传统汤剂样品溶液，见表1。

2.1.3 配方汤剂的制备 分别称取当归、生地、黄连各24g，升麻、牡丹皮各36g，按传统汤剂煎煮法制备各单味药材汤剂。并量好各单味药材汤剂体积，按处方比例混合即得配方汤剂，量好体积并用蒸馏水定容到500mL，0.45μm微孔滤膜过滤即得传统汤剂样品溶液，见表1。

表1 传统汤剂溶液与配方汤剂溶液的制备情况（mL）

2.1.4 合煎颗粒剂样品溶液的制备 按实验处方称取药材并按清胃散传统汤剂制备法得到合煎液，减压浓缩回流至近干，真空减压干燥即得处方颗粒剂，出膏率见表2。精密称取颗粒剂0.5g，置50mL容量瓶中，用甲醇定容。摇匀，滤过，取续滤液，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

2.1.5 分煎配方颗粒剂样品溶液的制备 分别称取单味药材，按合煎液制法，制备各单味药材饮片颗粒，并计算干膏率，见表2。根据出膏率换算并称取相当于饮片合煎液组成药材用量的各单味药材配方颗粒，混匀，得处方配方颗粒剂。精密称取配方颗粒剂0.5g置50mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，0.45μm微孔滤膜过滤，即得。

表2 清胃散颗粒剂与配方颗粒剂中单味药的出膏率（%，mL）

2.2.5 阴性样品溶液的制备 按实验处方称取药材饮片（除牡丹皮），并依照“2.1.2”项下制备即得丹皮酚阴性样品溶液。

2.2 色谱条件 采用Hypersil ODS2为色谱柱；流动相为甲醇-水（45∶55）为流动相；检测波长274nm；柱温25℃；流速：1.0 mL·min-1；理论板数按丹皮酚峰计算应不低于5000；重复性RSD%＜2%。进样量均为20μL，其丹皮酚对照品溶液、清胃散传统汤剂、配方汤剂及阴性样品溶液见图1。

图1 丹皮酚色谱峰

2.3 标准曲线的绘制 分别取1mL、3mL、4mL、5mL、6mL的0.3248mg·mL-1丹皮酚对照品溶液定容到25mL，分别进样20μL，以峰面积积分值（A）为纵坐标，浓度（C）为横坐标，绘制标准曲线，作线性回归方程得A＝6 ×106C＋38001，r＝0.9999，结果表明丹皮酚在0.2598μg到6.4960μg浓度范围内线性关系良好。

2.4 专属性实验 分别注入20μL清胃散传统汤剂、配方汤剂、阴性样品溶液及丹皮酚对照品溶液于高效液相色谱仪中，记录色谱图。结果表明传统汤剂在与丹皮酚对照品保留时间相应的位置有色谱峰，而阴性样品溶液则无色谱峰。

2.5 精密度实验 精密吸取丹皮酚对照品溶液20μL，重复进样6次，在色谱条件下测定各峰面积，其RSD为1.29%，表明仪器精密度良好。

2.6 重复性实验 按实验处方称取药材饮片，并依照“2.1.2”项下制备，平行制备6份样品溶液，同法测定，用外标法计算丹皮酚的含量，其RSD为0.85%，表明重复性良好。

2.7 稳定性实验 精密吸取同一样品供试液，每隔2h进一次样并测定丹皮酚含量，其RSD为1.81%，结果表明本试验方法在12小时内稳定。

2.8 加样回收率实验 分别精密称取已知含量的9份清胃散处方，按“2.1.2”项下制备，分别取10mL的溶液并加入样品中丹皮酚总含量80%，100%，120%的对照品各3份，实验得到其平均回收率为99.74%，RSD＝1.13%，表明方法可，结果见表3。

表3 样品回收率试验结果（mg，mL）

2.9 含量测定结果

2.9.1 清胃散传统汤剂和配方汤剂中丹皮酚的含量测定精密吸取适量的清胃散传统汤剂和配方汤剂溶液，在对应的色谱条件下平行测定6次，其丹皮酚的含量分别为0.50%，0.53%；其转移率分别为36.91%，38.71%。

2.9.2 清胃散颗粒剂和配方颗粒剂中丹皮酚的含量测定按上述汤剂样品溶液的制备方法，在色谱条件下进样，在丹皮酚的对应位置没有色谱峰存在，表明清胃散颗粒剂和配方颗粒剂中丹皮酚没有。

3 GC-MS方法与结果

3.1 处方挥发油成分的提取 精密称取一付清胃散处方（合计36g），采用水蒸气蒸馏法提取2次，每次2小时，合并两次提取得到的挥发油，以正己烷萃取2次，分液得到挥发油提取液［8～10］。

3.2 色谱条件 HP6890／5975C气相色谱仪，色谱柱为ZB-5MSI 5%Phenyl-95%DiMethylp-olysiloxane（30m×0.25mm×0.25μm）弹性石英毛细管柱，柱温45℃（保留2min），以4℃.mini-1升温至240℃，保持2min；汽化室温度250℃；载气为高纯He（99.999%）；柱前压7.62psi，载气流量1.0mL·min-1；不分流进样；溶剂延迟时间：1.5min。离子源为EI源；离子源温度230℃；四极杆温度150℃；电子能量70eV；发射电流34.6μA；倍增器电压1125V；接口温度280℃；质量范围20～450amu。

3.3 测定结果 挥发油气相色谱图共有21个峰，见图2；相应质谱图经Class-500色谱软件及NIST质谱谱库进行检索并结合文献调研，共鉴定了15个化合物如萘，4-乙烯基-2-甲氧基苯酚，丁香油，丹皮酚，藁本内酯，3-丁基苯酞，丁烯基苯酞，苯氧乙酸烯丙酯，异丙基联苯，亚丁基二氢-苯并呋喃酮，1，2，3-三甲基-4-丙烯基萘，正十七烷，正十八烷，正二十烷，2，6-丁基-4-甲基-2，5-环己二烯-1-酮，其中丹皮酚含量最高，相对百分含量88.7%。

图2 挥发油气相色谱图

4 讨论

丹皮酚在清胃散传统汤剂中的百分含量为0.50%，转移率为36.91%；而在配方汤剂中的百分含量为0.53%，转移率为38.71%。则两者之间无明显差异；而清胃散颗粒剂与配方颗粒剂中丹皮酚都没有，说明丹皮酚在制备成颗粒剂的过程中，随水蒸气蒸馏而出。而用气质联用技术测得清胃散中挥发油的组成和含量时，方中以丹皮酚最高，藁本内酯次之。若以丹皮酚为主要有效成分作为药效治理指标时，则不宜制备为颗粒剂使用。同时在四个HPLC色谱图的比较中发现，在颗粒剂的HPLC色谱图中发现有微量成分发生了变化，具体情况还需要进一步的研究。

［1］蒋健．清胃散临床运用发挥［J］．陕西中医，2008，10（29）：1404．

［2］张健萍，李连珍，赵红江，等．牡丹皮的化学成分、药理作用及临床应用研究概况［J］．中华中医药杂志，2006，5（21）：295-296．

［3］刘雪君，陈维宁，戴功．丹皮酚的镇痛作用和无耐受性研究［J］．中国药理学通报，1993，9（6）：464-467．

［4］陈江斌，唐其柱，黄从新，等．丹皮酚对心肌细胞自律性和延迟后除极的影响［J］．中国应用生理学杂志，1999，15（4）：332-334．

［5］戴敏，訾晓梅，彭代银，等．丹皮酚抗鹌鹑实验性动脉粥样硬化作用［J］．中国中药杂志，1999，24（8）：488-490．

［6］国家药典委员会．中国药典．一部［S］．北京：化学工业出版社，2010：160-161．

［7］程磐基，宋元．明清药物剂量的考证与研究［J］．上海中医药杂志，2004，38（7）：628．

［8］高丽丽，朱文娟，罗晓健．水蒸气蒸馏法提取丹皮酚工艺研究［J］．中国医学创新，2009，6（14）：18-19．

［9］吴虹，吴健．气相色谱法测定六味地黄颗粒中丹皮酚的含量［J］．基层中药杂志，2002，16（1）：24-25．

［10］赵新峰，王伟，孙毓庆．毛细管区带电泳法测定牡丹皮中芍药苷的含量［J］．中草药，2003，34（3）：271-272．

Content Change Analysis of Paeonolin Different Decoctions of Qingwei Power

Shao Jinming1Le Zhanxia1Wang Daoping2Zhang Mingchang1XU W enfen1M A Xiuping1✫
（1 Guiyang college of traditional Chinese medicine，Guiyang，550002，China；2 The key laboratory of Chemistry for natural products of Guizhou province and Chinese academy of sciences，Guiyang，550007，China）

Objective To investigate the content change of paeonol in different decoctions of Qingwei Power．Methods Using HPLC determine the content of paeonol in the different decoctions of Qingwei San and GC－MS technical analysis of volatile oils prescription．Results The average content of paeonol in Qingwei Power traditional decoction and Recipe decoction were 0.12%，0.13%，but the Decoction particles and formulated granular decoction for Qingwei Power were not detected，while mass spectrometry technique to detect the paeonol of volatile oil was 88.7%．Conclusino The result of this experiment provided reference to clinic use in reason about Qingwei San．

Paeonol；Qingwei Power；Vlatile oil；HPLC；Moutan

10.3969／j.issn.1672-2779.2014.05.099

1672-2779（2014）-05-0156-03

杨 杰 本文校对：彭小冰

2013-11-11）

*通讯作者