荷斯坦奶牛CN和DUMPS遗传缺陷病的巢式PCR检测方法的建立和应用

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（1.华南农业大学兽医学院，广东广州 510642；2.广东出入境检验检疫局，广东广州 510623；3苏州科技学院，江苏苏州 215009）

荷斯坦奶牛CN和DUMPS遗传缺陷病的巢式PCR检测方法的建立和应用

代元元1，吴晓薇1，2，洪洁心2，王怡飞1，刘中勇2，赵天楚1，郭 卉3，郭霄峰1

（1.华南农业大学兽医学院，广东广州510642；2.广东出入境检验检疫局，广东广州510623；3苏州科技学院，江苏苏州215009）

为建立荷斯坦奶牛瓜氨酸血症和尿苷酸核酶缺乏症两种遗传缺陷病的检测方法，根据文献报道的精氨酸琥珀酸合成酶、UMPS基因核苷酸序列，设计引物，通过条件的优化，建立了巢式PCR反应体系。结合PCR产物测序，建立了检测CN和DUMPS方法。取243份临床牛血清样品用巢式PCR检测并测序，发现CN野生型238份，CN杂合子型5份，CN突变型0份；DUMPS野生型236份，DUMPS杂合子型5份，DUMPS突变型2份。所建立的巢式PCR方法灵敏、特异，还兼具高通量的特点，适合口岸对荷斯坦奶牛CN和DUMPS遗传缺陷病的大样品量检测。

荷斯坦奶牛；瓜氨酸血症；尿苷酸核酶缺乏症；巢式PCR

人工授精和胚胎移植技术在全球范围内得到推广和应用，显著提高了奶牛的遗传性能，但奶牛优秀品质（胚胎、精液、种牛）的广泛流通应用使得一些隐性遗传疾病基因扩散，对全球各国奶业造成巨大的经济损失。奶业发达国家已建立了完善的遗传缺陷检测和监控体系，使隐性有害基因频率逐年降低［1］。因此，建立奶牛遗传缺陷病的检测方法具有重要意义。

瓜氨酸血症（citrullinemia，CN）是荷斯坦牛尿素循环发生代谢紊乱的一种常染色体单基因隐性遗传缺陷病，最早于1986年在澳大利亚的荷斯坦牛群中发现［2］。病牛出生时表现正常， 但不久后出现精神沉郁、步态紊乱、惊厥、失明等症状， 一般出生后 5天死亡， 死亡率达 100%［3］。CN遗传学基础是由奶牛第11号染色体（BTA11）上编码精氨酸琥珀酸合成酶（argininosuccinate synthase， ASS）的基因第5外显子发生 C→T 的点突变， 使密码子 CGA 转变为终止密码子 TGA，从而其翻译产物—精氨酸琥珀酸合成酶变成了截短了的 85 个氨基酸的蛋白质（ 正常为 412 个氨基酸）， 而失去精氨酸合成酶活性，造成尿素循环发生代谢障碍， 进而导致血清淀粉酶过高［4-5］。

尿 苷 酸 合 酶 缺 乏 症（def i ciency of uridine monophophate synthase， DUMPS）是荷斯坦牛胚胎早期死亡的一种常染色体单基因隐性遗传缺陷病，最早于1987年在美国的荷斯坦牛中发现［6］。临床症状为血液中瓜氨酸含量升高，尿素循环受阻引起高氨血症，从而导致犊牛在出生一周内死亡，或者母牛怀孕40天左右时发生流产［7］。DUMPS的遗传学基础是奶牛1号染色体（BTA1）上的UMPS基因C-末端密码子405处存在着一个C→T点突变，可导致原来编码精氨酸的CGA转变为编码终止密码子的TGA，导致基因编码产物催化亚基C-末端缺失76个氨基酸［8］。由于这种蛋白质的酶催化功能丧失，造成其作用底物乳清酸的大量积累［9-10］。

针对CN和DUMPS的突变位点具有单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），当前主要有PCR-RFLP和AS-PCR两种方法进行检测方法。另外，还有变性高效液相色谱（DHPLC）、高分辨溶解曲线（HRM）技术用于检测CN和DUMPS，因仪器要求较高和材料成本较大，这些未能广泛应用。本研究通过巢式PCR结合DNA测序的方法对CN和DUMPS两种常见遗传缺陷病进行检测，满足高通量、高灵敏度、高效率的筛查体系要求，对我国荷斯坦奶牛的CN和DUMPS两种遗传病的检测和监控，提高种群质量具有重要意义。

1 材料与方法

1.1试验材料

随机颈静脉采集江苏某隔离场243头荷斯坦奶牛的血液样本，5mL/头，置于含肝素钠抗凝剂的真空管中，摇匀后分装于另外的离心管中，每管2mL，-20℃冻存备。

1.2基因组DNA提取

采用Promega Maxwell 16 核酸提取仪进行血液基因组DNA的提取，使用配套试剂盒Promega AS1010。程序设置完成后，将400μL血液样品加入cartridge的第1个槽，在每个cartridge前面对应的洗脱管插槽里放置洗脱管，在洗脱管里加入300μL 洗脱缓冲液，运行程序。DNA提取完毕后，将其从洗脱管中转移至指形离心管中，采用超微量核酸蛋白测定仪ND-1000和1%琼脂糖凝胶电泳进行基因组DNA浓度和纯度的检测。

1.3引物设计

参考NCBI数据库中ASS基因序列（GenBank Gene ID： 280726）和UMPS基因序列（GenBank Gene ID： 281568）设计巢式PCR引物。ASS基因第一次PCR引物为CP1（F）、CP2（R），第二次PCR引物为CP3（F）、CP4（R）；UMPS基因第一次PCR引物为DP1（F）、DP2（R），第二次PCR引物为DP3（F）、DP4（R） （表1）。

表1 荷斯坦奶牛ASS基因和UMPS基因的巢式PCR引物

1.4试验设计

本试验采用高特异性和灵敏性的巢式PCR法对荷斯坦奶牛的ASS基因和UMPS基因进行鉴定。首先用引物P1和P2进行约30个循环的扩增，然后取第一轮扩增产物稀释100倍作为第二次PCR反应的模板，加入引物P3和P4进行约30个循环的扩增，将第二次PCR扩增产物进行DNA测序，分析测序结果判定是否携带CN或DUMPS有害基因。

1.5巢式PCR反应体系的优化

1.5.1退火温度的确定

PCR反应体系中其他条件保持不变，设置梯度退火温度，根据扩增结果确定最佳退火温度。

1.5.2引物浓度的确定

PCR反应体系中其他条件保持不变，设置引物浓度分别为0.04，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2μmol/L，根据扩增结果确定最佳引物浓度。

1.5.3pfu DNA聚合酶用量的确定

PCR反应体系其他条件保持不变，设置pfu DNA聚合酶分别为0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35，0.4，0.45，0.5μL，根据扩增结果确定pfu DNA聚合酶的最佳用量。

1.5.4dNTP 用量的确定

PCR反应体系其他条件保持不变（25μL反应体系），设置dNTP分别为0.5，1，1.5，2，2.5，3μL，根据扩增结果确定dNTP的最佳用量。

1.5.5延伸温度的确定

PCR反应体系其他条件保持不变（25μL反应体系），设置延伸温度分别为67，68，69，70，71，72℃，根据扩增结果确定最佳延伸温度。

1.6巢式PCR的敏感性测定

采用微量核酸分析仪检测样品DNA浓度。将所提取的DNA样品作10倍梯度稀释，然后每个稀释度取0.5μL为模板，按巢式PCR反应条件进行两轮扩增反应，反应结束后进行凝胶电泳检测。

1.7巢式PCR的特异性试验

用羊、猪、犬、鸡的血液DNA提取物为模板，采用相同的巢式PCR反应体系进行扩增，每次扩增反应同时设双蒸水作空白对照和荷斯坦奶牛作模板的阳性对照，扩增反应结束后用凝胶电泳检测。

1.8临床样品的巢式PCR检测

将243份样品进行巢式PCR，产物送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序，测序结果用DNAMAN软件进行分析。

2 结果与分析

2.1牛基因组DNA提取与鉴定

血液提取的基因组DNA，经1%琼脂糖凝胶电泳，可清晰看到牛血液基因组DNA扩出的条带。经微量核酸分析仪检测，牛血液样品DNA浓度为83 ng/μL。

2.2巢式PCR反应体系的优化

2.2.1ASS基因巢式PCR优化结果

第一次PCR反应体系为25μL，包括样品DNA 0.5μL（41.5 ng）、上游引物CP1和下游引物 CP2各 0.5μL（10μmol/L），10×Pfu Buffer 2.5μL、dNTP Mixture（2.5 mmol/L）2.5μL、Pfu DNA Polymerase酶（2.5U/ul）0.25μL、ddH20 18.75μL。扩增程序为：94℃预变性 3min；94℃变性30s，66.2℃退火30s，70℃延伸20s，30个循环；70℃再延伸1min，4℃终止反应。

第二次PCR反应体系为50μL，包括将第一次PCR产物稀释100倍作为第二次PCR反应的模板DNA 1μL、上游引物CP3和下游引物CP4各1μL（10μmol/L）、10×Pfu Buffer 5μL、dNTP Mixture（2.5 mmol/L） 5μL、Pfu DNA Polymerase酶（2.5U/ul）0.5μL、ddH20 37.5μL。 扩增 程 序为：94℃预变性 3min；94℃变性30s，61.2℃退火30s，70.4℃延伸15s，30个循环；70.4℃再延伸1min，4℃终止反应。

2.2.2UMPS基因巢式PCR优化结果

除上游引物和下游引物分别为DP1和DP2外，UMPS基因第一次PCR反应体系与ASS基因第一次PCR体系相同，为25μL。扩增程序为：94℃预变性 3min；94℃变性30s，51.4℃退火30s，70℃延伸15s，30个循环；70℃再延伸1min，4℃终止反应。

除上游引物和下游引物分别为DP3和DP4外，UMPS基因第二次PCR反应体系与ASS基因第二次PCR体系相同，为50μL。扩增程序为：94℃预变性 3min；94℃变性30s，65℃退火30s，68℃延伸15s，30个循环；68℃再延伸1min，4℃终止反应。

2.3巢式PCR的敏感性

经微量核酸分析仪检测样品DNA浓度为83 ng/μL。样品DNA依次做10倍梯度稀释后作为模板进行巢式PCR反应，反应结束后进行凝胶电泳检测， ASS基因和UMPS基因的敏感性结果分别如图1和图2所示。根据检测结果，ASS基因的巢式PCR敏感性为0.83 ng/μL；UMPS基因的巢式PCR敏感性为0.83 ng/μL。

2.4巢式PCR的特异性

以牛、羊、猪、犬、鸡的血液DNA提取物为模板，采用同样的巢式PCR反应体系进行扩增后进行凝胶电泳检测，结果如图3和图4所示。检测结果表明，此巢式PCR检测方法对荷斯坦奶牛的ASS基因和DUMPS基因具有特异性。

图1 ASS基因巢式PCR敏感性试验结果

图2 UMPS基因巢式PCR敏感性试验结果

图3 ASS基因巢式PCR特异性试验结果

2.5试验样品的巢式PCR方法检测

图4 UMPS基因巢式PCR特异性试验结果

用所建立的巢式PCR方法对243份试验样品进行检测，扩增产物的测序结果用DNAMAN软件分析，箭头所标位点为导致CN和DUMPS的SNP位点。测序图分析：如果测序图中该SNP位点为单峰C，则为非CN或DUMPS有害基因携带者；该SNP位点如果为双峰，同时含有C和T，则为CN或DUMPS有害基因携带者；该SNP位点为单峰T，则为CN或DUMPS患者。ASS基因序列图如图5所示，A为野生型、B为杂合子型，未发现突变型；UMPS基因序列图如图6所示，C为野生型、D为杂合子型，E为突变型。

243份样品中，CN野生型238份，CN杂合子型5份，CN突变型0份；DUMPS野生型236份，DUMPS杂合子型5份，DUMPS突变型2份。

图5 ASS基因序列图

图6 UMPS基因序列图

3 讨论

本研究表明我国荷斯坦奶牛群中存在CN和DUMPS两种常见隐性遗传缺陷病。我国每年从美国、加拿大、德国、澳大利亚、新西兰和乌拉圭等国进口大量奶牛优秀种质，进口时检疫重点在于防止动物传染病和寄生虫病的传入，却没有包括防止牛遗传缺陷的检疫要求，所以存在的牛遗传性缺陷携带者进入我国的风险。CN和DUMPS这类单基因隐形遗传缺陷病，如果两个杂合子亲本配种的后代将有四分之一的概率患病，还有二分之一的概率为有害基因携带者，对我国奶牛种群质量产生严重影响，应予以充分重视，建立必要的检测方法。

本研究通过建立CN和DUMPS两种遗传缺陷病的巢式PCR扩增结合基因测序的方法，能够满足高通量、高灵敏度、高准确度的检测需要。而目前常用的PCR-RFLP方法是通过在突变点处设计酶切位点，PCR扩增后酶切PCR产物判断是否含有突变点，该方法引入错配碱基后，PCR的扩增效率会受到影响，另外存在假阳性的可能。ASPCR方法根据突变位点设计特异的引物，一条链与突变位点的一种碱基状态互补，另一条链按常规方法进行设计，根据扩增产物的有无判断是否有碱基的突变，该方法虽操作简便，成本低，但有时即使引物的3'末端的碱基与模板的碱基不互补，延伸仍然可以进行，容易造成结果的误判。本研究建立的方法避免了其他方法需要凝胶电泳带来的低效率和生物污染，满足了大通量、安全、高效的需要；巢式PCR能够较好的避免PCR产物浓度过低的发生，而且第二次PCR能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低，因此具有高灵敏性；最终结果的判定是通过基因测序来进行的，可直接测出突变位点的碱基变化，确保了结果的准确性，避免假阳性现象。因此，本研究特别是能够满足快速、精准、高通量等特点的进出口贸易过程检测技术的需求。

4 结论

本研究成功设计了检测荷斯坦奶牛两种常见隐性遗传缺陷病CN和DUMPS的通用引物，并建立了检测了相关基因ASS和UMPS基因的巢式PCR检测体系，测定了该方法的敏感性和特异性，并成功用于243份样品的检测。本研究的方法具有高通量、高灵敏度、高准确度的特点，对建立我国荷斯坦奶牛CN和DUMPS两种隐性遗传病的检测和监控体系具有重要意义。

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Development and Application of a Nested PCR Assay for Detection of CN and DUMPS in Holstein Cattle

Dai Yuanyuan1， Wu Xiaowei1，2， Hong Jiexin2， Wang Yifei1， Liu Zhongyong2， Zhao Tianchu1， Guo Hui3， Guo Xiaofeng1
（1.College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China； 2. Guangdong Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， 510623； 3. Suzhou University of Science and Technology， Suzhow， Jiangsu 215009 ）

The aim of the study was to develop a diagnostic method for detecting the two genetic defects---CN and DUMPS in Holstein cattle. Nested PCR primers were designed based on ASS gene and UMPS gene and PCR conditions were optimized. 243 cow blood samples were detected to conf i rm the presence of CN and DUMPS in the cows using the developed Nested PCR method and the PCR products were sequenced. The results showed that 238 cows were without CN， 5 suffered from heterozygote CN， and 236 cows without DUMPS， 5 heterozygote DUMPS and 2 mutant DUMPS respectively. These results indicated that the new assay was suitable to handle large quantity of CN and DUMPS def i cient dairy cows in port quarantine inspection.

Holstein cattle； CN； DUMPS； nested PCR

S856.1；S823

： A

：1005-944X（2014）01-0076-06