板蓝根抗氧化成分的提取及活性分析

赵琳静，李洪森，吴晓英，乔 妍，王 磊，林旭东，燕方龙

（上海工程技术大学化学化工学院，上海201620）

板蓝根抗氧化成分的提取及活性分析

赵琳静，李洪森，吴晓英，乔 妍，王 磊，林旭东，燕方龙*

（上海工程技术大学化学化工学院，上海201620）

采用95%乙醇提取板蓝根，并用石油醚、氯仿和正丁醇依次萃取，醇提后药渣通过水提醇沉法制备粗多糖。采用铁氰化钾还原反应、超氧阴离子自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基三种抗氧化模型，比较上述极性部位的抗氧化活性，并考察抗氧化活性与总糖含量的关系。结果表明，板蓝根不同极性部位的抗氧化活性差异较大，与总糖含量相关性较小。其中，氯仿萃取物对超氧阴离子自由基和DPPH自由基的清除率最高，IC50值分别为3.38、0.19mg/mL，是从板蓝根中筛选非多糖类天然抗氧化剂的重要部位。醇提后药渣通过水提醇沉法制得的粗多糖部位总糖含量最高，为18.66%。板蓝根所具有的抗氧化活性可能是该药发挥解“内毒”作用的重要机制。

板蓝根，抗氧化，多糖，还原能力，超氧阴离子自由基，DPPH自由基

板蓝根（Indigowoad Root）为我国清热解毒类代表药物，别名蓝靛根、靛青根等，是十字花科植物菘蓝（Isatis indigotica Fort.）的干燥根，具有抗菌、抗病毒、抗内毒素、抗炎、抗肿瘤及免疫调节等药理活性[1]。自由基是生物体氧化反应产生的“内生毒素”，与机体许多功能障碍和疾病发生，如吞噬、中毒、炎症、肿瘤、衰老、辐射损伤等有密切关系，由自由基所引起的疾病已多达100余种[2]。从减少自由基的堆积、抑制过氧化反应角度研究清热解毒类中药的作用机制具有重要意义[3]。

多糖广泛存在于自然界，是许多植物中草药有效成分之一，具有提高抗氧化酶活性、清除自由基、抑制脂质过氧化等作用[4]。现代药理研究证实，板蓝根多糖在体外、体内也均显示出较好的抗氧化作用[5-6]。但是，迄今为止，尚未见有关系统考察板蓝根不同极性部位中多糖含量与抗氧化性能关系的报道。本研究采用95%乙醇提取板蓝根，并用石油醚、氯仿和正丁醇依次萃取，醇提后药渣通过水提醇沉法制备粗多糖。采用苯酚-硫酸法及铁氰化钾还原反应、超氧阴离子自由基和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基三种抗氧化模型，测定板蓝根不同极性部位的多糖含量，研究其体外抗氧化活性，并对抗氧化活性与多糖含量的关系进行分析，为后期进一步开展板蓝根抗氧化活性成分的筛选及机制研究提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

板蓝根饮片 购自上海余天成医药有限公司，40℃干燥，粉碎，过20目筛；二苯代苦味酰基自由基（DPPH·） 购自Sigma-Fluka公司；无水乙醇、石油醚、氯仿、正丁醇、葡萄糖、铁氰化钾、邻苯三酚、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等 均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

UV-7504紫外可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司；HH-2电热恒温水浴锅 上海逸龙科技有限公司；DZF-6050真空干燥箱 上海一恒科技有限公司；RE-2000旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 板蓝根醇提物、各分级萃取物及总糖部位的制备[7]称取板蓝根粉末150g，加入750mL 95%乙醇水浴提取两次，每次3h。过滤，合并滤液，减压浓缩，40℃真空干燥，得板蓝根乙醇提取物（EE），称重并计算提取率。将所得EE分散于水中，采用系统溶剂萃取法分级萃取，依次得石油醚部位（PEF）、氯仿部位（CF）、正丁醇部位（BF）及剩余水层（WR）。将各部位旋转浓缩，真空干燥，称重并计算提取率。

称取干燥后板蓝根滤渣，加40倍体积水于80℃水浴提取1.5h，过滤，滤液旋转浓缩后加无水乙醇使含醇量达75%，4℃静置过夜。过滤，沉淀物40℃真空干燥，得板蓝根粗多糖（CPS），称重并计算提取率。

1.2.2 总糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法[8]测定不同极性部位总糖含量。以无水葡萄糖为标准品。

总糖含量（%）=总糖质量/提取物质量×100

1.2.3 还原能力的测定 采用铁氰化钾还原法[7]进行。2.5mL磷酸盐缓冲溶液（pH6.6）中加入2.5mL供试品溶液及2.5mL 1%铁氰化钾溶液，振荡混匀后于50℃水浴反应20min。急速冷却，加2.5mL 10%三氯乙酸，3000r/min离心10min。取上层清液5mL，加入5mL水和1mL 0.1%FeCl3，混匀，室温静置10min后于700nm测吸光度（A）。每个样本平行处理三次。

1.2.4 清除超氧阴离子自由基（O2-·）能力的测定 通过邻苯三酚自氧化反应产生O2-·，参照文献方法[9-10]并略加修改。精密移取50mmol·L-1Tris-HCl缓冲液（pH8.20）6mL于具塞试管中，加入供试液1mL，于37℃水浴保温10min，然后加入37℃预热的7mmol/L邻苯三酚1.0mL，混匀，准确反应4min后，迅速用0.5mL浓盐酸终止反应，于320nm测定吸光度（A）。以BHT和维生素C为阳性对照。每个样本平行处理三次。按照以下公式，计算板蓝根不同极性部位对体系中O2-·的清除能力。

清除率（%）=[（A空－A测）/A空]×100

式中，A空为邻苯三酚自氧化反应速率，A测为加入各极性部位后邻苯三酚自氧化反应速率。

如果O2-·清除率与样品浓度的量效关系呈线性，则求出回归方程和相关系数R2，计算清除率达50%时所需的样品量IC50。

1.2.5 清除DPPH自由基（DPPH·）能力的测定 参照文献[11]进行。精密移取不同浓度的各供试品溶液2mL于具塞试管中，加入0.1mmol·L-1的DPPH·溶液2mL，振荡后室温反应30min，于517nm测定吸光度（A）。以BHT和维生素C为阳性对照。每个样本平行处理三次。按照以下公式，计算板蓝根不同极性部位对DPPH·的清除能力。

清除率（%）=[1－（A1－A2）/A0]×100

式中，A1为2mL DPPH·溶液与2mL样品液混合后测得的吸光度；A2为2mL样品液与2mL无水乙醇混合后测得的吸光度；A0为2mL DPPH·溶液与2mL无水乙醇混合后测得的吸光度。

如果DPPH·清除率与样品浓度的量效关系呈线性，则求出回归方程和相关系数R2，计算清除率达50%时所需的样品量IC50。

1.2.6 数据处理 数据采用SPSS 16.0软件进行双变量相关性分析，以p＜0.05为差异显著。文中所有数据均以平均数±标准差（mean±SD）表示。

2 结果与分析

2.1 葡萄糖标准曲线的建立

按1.2.2项下方法，以吸光度A为纵坐标、浓度C（μg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y= 0.054X+0.017，R2=0.098。结果表明，无水葡萄糖在5～40μg/mL浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。

2.2 板蓝根不同极性部位的提取率和总糖含量

板蓝根乙醇总提物EE经液-液萃取得到的4个萃取部位的提取率顺序为WR＞BF＞PEF＞CF，醇提后药渣经水提醇沉法得到的CPS提取率为13.42%。根据回归方程计算各部位中总多糖含量（表1）。结果表明，板蓝根乙醇提取物EE中总糖含量远远低于药渣经水提醇沉获得的CPS中总糖含量。醇提物四个分级萃取产物（PEF、CF、BF和WR）的总糖含量随提取溶剂极性增加而增大，与多糖极性大、难溶于脂溶性有机溶剂有关。

表1 板蓝根不同极性部位的提取率和总糖含量Table 1 Yields and total sugar contents of different polar fraction from Indigowoad Root

2.3 板蓝根不同极性部位的还原能力测定

还原能力反映了物质的供电子能力，是评价物质体外抗氧化活性常用的指标，可间接反映抗氧化活性的强弱。铁氰化钾还原法的原理是，具有还原能力的物质可使铁氰化钾被还原成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾在酸性条件下与Fe3+络合形成普鲁士蓝，在700nm处有最大吸收。因此，吸光度越大，表示样品的还原能力越强。

K3Fe（CN）6+样品→K4Fe（CN）6+样品氧化物

K4Fe（CN）6+Fe3+→Fe4[Fe（CN）6]3

由图1可知，各供试液浓度与还原能力呈正相关，随着样品浓度增大，还原能力不断增强。相同浓度时，CF的还原能力明显高于CPS及其他极性部位，还原能力顺序为：CF＞CPS＞EE＞WR＞PEF＞BF。

图1 板蓝根不同极性部位的还原能力（n=3）Fig.1 Reducing power of different polar fraction from Indigowoad Root（n=3）

2.4 板蓝根不同极性部位对O2-·的清除能力

O2-·为体内寿命最长的自由基，通常作为自由基链式反应的引发剂，生成活性更强的·OH，造成机体进一步氧化损伤。邻苯三酚在碱性条件下发生自氧化反应，释放O2-·，并形成一系列有色中间产物。抗氧化剂的加入可抑制该氧化过程，减少有色物生成，使吸光度减小。由图2可知，板蓝根不同极性部位对O2-·的清除能力明显低于阳性对照BHT和维生素C。相同浓度时，CF对O2-·的清除能力明显高于CPS及其他极性萃取部位，计算得IC50为3.38mg/mL。各极性部位清除率大小顺序为CF＞CPS＞BF＞EE＞WR＞PEF。

图2 板蓝根不同极性部位对超氧阴离子自由基的清除能力（%）（n=3）Fig.2 Scavenging superoxide free radical activities of different polar fraction from Indigowoad Root（%）（n=3）

2.5 板蓝根不同极性部位对DPPH·的清除能力

DPPH法是清除自由基能力测定的常用方法之一，广泛应用于各种天然提取物体外抗氧化活性的评价。DPPH·是一种稳定的、在醇溶液呈紫色的自由基，在517nm处有强吸收。抗氧化剂可使其在该波长处吸收减弱，且吸光度减小程度与自由基被清除程度呈线性关系。由图3可知，在测定浓度范围内，板蓝根6个极性萃取部位对DPPH·的清除能力明显高于对O2-·的清除能力，清除率大小顺序为CF＞BF＞EE＞CPS＞PEF＞WR。其中，CF和BF的清除能力高于其他部位，当浓度达到1.25mg/mL时，CF和BF的清除能力分别为89.34%和85.91%，接近阳性对照BHT和维生素C；IC50分别为0.19、0.62mg/mL。

图3 板蓝根不同极性部位对DPPH自由基的清除能力（%）（n=3）Fig.3 Scavenging DPPH free radical activities of different polar fraction from Indigowoad Root（%）（n=3）

2.6 相关性分析

板蓝根不同极性部位在三个抗氧化模型上表现出的活性与总糖含量进行了相关性分析，相关系数分别为：还原能力，r=0.004；O2-·清除率，r=0.248；DPPH·清除率，r=-0.444，且均无显著性差异。可见，板蓝根不同极性部位的抗氧化性与总糖含量相关性较小。

3 结论

板蓝根不同极性部位的抗氧化活性有较大差异，与总糖含量相关性较小。氯仿萃取部位表现出优于粗多糖及其他极性部位的还原能力和清除超氧阴离子自由基及DPPH自由基的能力，值得引起对板蓝根脂溶性抗氧化活性成分的进一步研究的关注。目前，板蓝根抗氧化活性成分的研究多集中在多糖部位，本实验所采用的系统比较研究策略为从板蓝根中筛选作用更强的天然抗氧化剂，并进一步探讨其作用机制提供了实验基础。

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Extraction of antioxidant components from Indigowoad Root and evaluation their antioxidation in vitro

ZHAO Lin-jing，LI Hong-sen，WU Xiao-ying，QIAO Yan，WANG Lei，LIN Xu-dong，YAN Fang-long*
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Shanghai University of Engineering Science，Shanghai 201620，China）

Indigowoad Root was extracted with 95%ethanol，and then the extract was partitioned with petroleum ether，chloroform and n-butanol successively.The crude polysaccharides was obtained from water extract and ethanol precipitate.The antioxidation of different end extracts were studied by potassium ferricyanide reduction assay，superoxide anion free radical scavenging assay and 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazy1（DPPH）radical scavenging assay.The relationship between the antioxidant activity and the content of total sugar was analysed.The results showed that the antioxidant activities had great difference in six polar extracts from Indigowoad Root，and the content of total sugar had low correlation with the activities.The chloroform extract showed that the highest radical scavenging rate on superoxide anion free radical and DPPH free radical，and the IC50were 3.38mg/mL and 0.19mg/mL，respectively.The chloroform extract was identified as an important fraction for further screening antioxidant components except polysaccharides.The highest content of total sugar came from crude polysaccharides extract and the content was 18.66%.The antioxidation could be one of the mechanisms in detoxication of Indigowoad Root.

Indigowoad Root；antioxidation；polysaccharides；reducing power；superoxide anion free radical；DPPH free radical

TS255.1

A

1002-0306（2014）10-0195-04

10.13386/j.issn1002-0306.2014.10.035

2013－10－09 *通讯联系人

赵琳静（1979-），女，博士在读，讲师，研究方向：天然产物提取与活性研究。

上海高校教师培养计划项目（B8938-11-0545）；上海市大学生创新训练项目（cs1204006）。