杨晓婧,赵红玲,高 杨,尹志峰,王良友
(承德医学院中药研究所,河北承德 067000)
技术方法
利用离子交换树脂和超滤膜纯化还原型谷胱甘肽的研究
杨晓婧,赵红玲,高杨,尹志峰,王良友
(承德医学院中药研究所,河北承德067000)
离子交换树脂;超滤膜;分离纯化
谷胱甘肽(GSH),即N-(N-L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸,是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的活性三肽,是细胞内非蛋白硫氢基团的主要组成部分,在活组织中具有护肝、解毒、清除自由基、抗氧化等重要的生理功能。临床上,GSH主要用于治疗肝脏疾病,也是治疗眼科疾病的药物,如早期老年性白内障、角膜溃疡、角膜炎等;同时,GSH也应用在食品和保健品上。随着对GSH研究的深入,在医疗、食品、保健等方便对GSH的需求量正在不断增加[1-2]。
传统分离纯化GSH的方法大多采用铜盐法、双水相法和树脂法,这些方法存在着污染严重、操作系统昂贵等不能量产的缺点[3]。由于GSH是两性物质且带有一定的电荷,而超滤膜的实验操作条件温和,在pH 1-14时均稳定,并能在90℃下正常工作,不易引起液体温度、pH的变化,可以防止生物大分子的变性、失活和自溶[4]。因此,本研究先选用超滤膜除去抽提液中的大分子蛋白,再利用离子交换树脂法分离GSH,选用001×7阳离子树脂分离纯化GSH,该方法省时有效,收率高。
1.1原料含有GSH的酵母抽提液,实验室自制。
1.2主要试剂GSH标准品(上海哈灵生物科技有限公司);001×7阳离子交换树脂(上海水益树脂有限公司);超滤膜,截留分子量为3000Da(杭州滤元膜科技有限公司);其余试剂均为分析纯。
1.3主要仪器Alltechp4426高效液相色谱仪(美国奥泰科技公司);色谱柱:ODS C18(250×4.6mm);752可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);BT01-100恒流泵(保定兰格恒流泵有限公司);Alphal-4LD冷冻干燥机(德国Christ公司)。
2.1GSH抽提液的制备收集冷冻的菌泥加水混匀后,100℃处理10min,4000r/min离心,取上清液,用稀盐酸调pH值为3。
2.2树脂的预处理一定量树脂→去离子水浸泡洗涤→1mol/L HCl浸泡(用量约为树脂的2-3倍)→去离子水洗至流出液pH值为中性→1mol/L NaOH浸泡(用量约为树脂的2-3倍)→1mol/L HCl浸泡(用量约为树脂的4-5倍)→去离子水洗至流出液pH为中性以上备用(注意不要产生气泡)。
2.3超滤膜的处理对超滤膜进行了操作温度和离心转速的考察。
2.3.1操作温度对超滤膜的影响:控制离心转速为4000r/ min的条件下,探讨不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃)对膜截留量的影响。结果见图1:膜截留量随温度的升高而升高,温度升高有利于传质、膜截留量增大,但考虑到高温易使蛋白质变性失活,操作温度宜选择25℃。
图1 操作温度对超滤膜的影响
2.3.2离心转速对超滤膜的影响:控制洗脱液温度为25℃,探讨不同离心转速(2000r/min、3000r/min、4000r/ min)对膜截留量的影响。结果见图2:膜截留量随转速的增加而升高,峰值出现在4000r/min,为最佳转速。
图2 离心转速对超滤膜的影响
2.4静态吸附实验将2.2中处理过的树脂放入锥形瓶中,分别调pH值为2、3、4、5、6后加入GSH抽提液,25℃下恒温振荡,每隔30min测定一次树脂吸附量,直至吸附量基本不变。图3为上样30min、60min后测得树脂吸附GSH的量,结果显示:树脂对GSH的吸附在pH=2时出现峰值,但吸附的杂质较多,再结合GSH的性质综合考虑,因此应采用pH=3。图4显示,树脂在90min时吸附量基本达到饱和状态,至反应24h后吸附量仍然不变。通过四氧嘧啶法计算树脂的吸附量为1.153mg GSH/g树脂。
图3 静态吸附实验pH值选择结果
图4 静态吸附实验结果
2.5洗脱流速的选择取GSH抽提液,调节pH值为3,上样,适量洗脱液洗脱,以确定合适的洗脱速度。结果见图5:洗脱液吸光度值A最大效果最佳,即最佳流速为2ml/min。洗脱时,流速不仅影响GSH的洗脱效果,还会影响洗脱体积。洗脱太慢,洗脱液体积大,耗时长;洗脱快,GSH洗脱率低,损耗大。
图5 不同流速对GSH洗脱的影响
2.6洗脱液的选择分别选用0.1M冰醋酸、0.35M冰醋酸,0.1M NaOH、0.2M NaOH,0.3M醋 酸 钠+0.1M NaOH作为洗脱剂,检测洗脱液中GSH的含量,并计算GSH的回收率。结果见表1:用冰醋酸洗脱时体积较大,冻干繁琐,时间长。因此,选择洗脱体积小且回收率高的0.2M NaOH洗脱,且GSH能集中洗脱下来,所含杂质较少。
表1 不同试剂洗脱对GSH回收率的影响
2.7洗脱终点的判断采用亚硝基铁氰化钠法检测,取一滴洗脱液,滴入1.5%亚硝基铁氰化钠溶液(饱和硫酸铵溶液配制),观察颜色变化,如果颜色变为红色,表明还未洗脱完全,反之,则洗脱液中无GSH存在,停止洗脱。
2.8GSH的测定采用HPLC法测定GSH的纯度,选用C18柱,流动相:缓冲液A:0.1%TFA,H2O,缓冲液B:0.1%TFA,CH3CN,恒度洗脱,A:B=95:5(体积比);流速:0.8ml/min,测波长:214nm。结果显示样品出峰时间与标准品比较,时间基本一致,初步确定产品为GSH,所得产品的HPLC纯度为37.55%。
2.9001×7阳离子交换树脂对GSH的分离纯化重复扩大实验结果在25℃、4000r/min的条件下利用超滤膜除去大分子蛋白,上柱最适宜pH=3,洗脱液为0.2M NaOH,洗脱流速为2.0ml/min,进行重复扩大实验。果见表2,GSH的平均回收率为73.94%。
表2 001×7阳离子交换树脂对GSH的分离纯化重复扩大实验结果
采用001×7阳离子交换树脂和超滤膜结合的方法分离纯化GSH,结果显示此方法可行,可为GSH的进一步扩大生产提供实验数据。根据实验结果确定在25℃、4000r/min的条件下利用超滤膜除去大分子蛋白,上柱最适宜pH值为3洗脱液为0.2M NaOH,洗脱流速为2.0ml/min,产品GSH的纯度为37.55%。
[1]王大慧,卫功元.谷胱甘肽的应用前景及生产研究现状[J].化学与生物工程,2004,(3):10-12.
[2]周宇光,付国平,肖仔君.谷胱甘肽的生产和应用研究进展[J].食品工业科技,2003,(3):89-91.
[3]邱雁临,胡静,缪谨枫,等.利用大孔树脂从啤酒废酵母中分离谷胱甘肽[J].吉首大学学报,2008,29(1):83-86.
[4]樊文玲,詹秀琴,林瑛.超滤膜分离地龙匀浆液中蛋白物质的操作条件优化研究[J].中成药,2007,29(11):1598-1601.
Q517
B
1004-6879(2014)03-0239-03
2013-10-16)