利用离子交换树脂和超滤膜纯化还原型谷胱甘肽的研究

杨晓婧，赵红玲，高　杨，尹志峰，王良友

(承德医学院中药研究所，河北承德　067000)

技术方法

利用离子交换树脂和超滤膜纯化还原型谷胱甘肽的研究

杨晓婧，赵红玲，高杨，尹志峰，王良友

(承德医学院中药研究所，河北承德067000)

离子交换树脂;超滤膜;分离纯化

谷胱甘肽(GSH)，即N-(N-L-γ-谷氨酰-L-半胱氨酰)甘氨酸，是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的活性三肽，是细胞内非蛋白硫氢基团的主要组成部分，在活组织中具有护肝、解毒、清除自由基、抗氧化等重要的生理功能。临床上，GSH主要用于治疗肝脏疾病，也是治疗眼科疾病的药物，如早期老年性白内障、角膜溃疡、角膜炎等;同时，GSH也应用在食品和保健品上。随着对GSH研究的深入，在医疗、食品、保健等方便对GSH的需求量正在不断增加[1-2]。

传统分离纯化GSH的方法大多采用铜盐法、双水相法和树脂法，这些方法存在着污染严重、操作系统昂贵等不能量产的缺点[3]。由于GSH是两性物质且带有一定的电荷，而超滤膜的实验操作条件温和，在pH 1-14时均稳定，并能在90℃下正常工作，不易引起液体温度、pH的变化，可以防止生物大分子的变性、失活和自溶[4]。因此，本研究先选用超滤膜除去抽提液中的大分子蛋白，再利用离子交换树脂法分离GSH，选用001×7阳离子树脂分离纯化GSH，该方法省时有效，收率高。

1 试剂与仪器

1.1原料含有GSH的酵母抽提液，实验室自制。

1.2主要试剂GSH标准品(上海哈灵生物科技有限公司);001×7阳离子交换树脂(上海水益树脂有限公司);超滤膜，截留分子量为3000Da(杭州滤元膜科技有限公司);其余试剂均为分析纯。

1.3主要仪器Alltechp4426高效液相色谱仪(美国奥泰科技公司);色谱柱:ODS C18(250×4.6mm);752可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);BT01-100恒流泵(保定兰格恒流泵有限公司);Alphal-4LD冷冻干燥机(德国Christ公司)。

2 方法与结果

2.1GSH抽提液的制备收集冷冻的菌泥加水混匀后，100℃处理10min，4000r/min离心，取上清液，用稀盐酸调pH值为3。

2.2树脂的预处理一定量树脂→去离子水浸泡洗涤→1mol/L HCl浸泡(用量约为树脂的2-3倍)→去离子水洗至流出液pH值为中性→1mol/L NaOH浸泡(用量约为树脂的2-3倍)→1mol/L HCl浸泡(用量约为树脂的4-5倍)→去离子水洗至流出液pH为中性以上备用(注意不要产生气泡)。

2.3超滤膜的处理对超滤膜进行了操作温度和离心转速的考察。

2.3.1操作温度对超滤膜的影响:控制离心转速为4000r/ min的条件下，探讨不同温度(15℃、20℃、25℃、30℃、35℃)对膜截留量的影响。结果见图1:膜截留量随温度的升高而升高，温度升高有利于传质、膜截留量增大，但考虑到高温易使蛋白质变性失活，操作温度宜选择25℃。

图1 操作温度对超滤膜的影响

2.3.2离心转速对超滤膜的影响:控制洗脱液温度为25℃，探讨不同离心转速(2000r/min、3000r/min、4000r/ min)对膜截留量的影响。结果见图2:膜截留量随转速的增加而升高，峰值出现在4000r/min，为最佳转速。

图2 离心转速对超滤膜的影响

2.4静态吸附实验将2.2中处理过的树脂放入锥形瓶中，分别调pH值为2、3、4、5、6后加入GSH抽提液，25℃下恒温振荡，每隔30min测定一次树脂吸附量，直至吸附量基本不变。图3为上样30min、60min后测得树脂吸附GSH的量，结果显示:树脂对GSH的吸附在pH=2时出现峰值，但吸附的杂质较多，再结合GSH的性质综合考虑，因此应采用pH=3。图4显示，树脂在90min时吸附量基本达到饱和状态，至反应24h后吸附量仍然不变。通过四氧嘧啶法计算树脂的吸附量为1.153mg GSH/g树脂。

图3 静态吸附实验pH值选择结果

图4 静态吸附实验结果

2.5洗脱流速的选择取GSH抽提液，调节pH值为3，上样，适量洗脱液洗脱，以确定合适的洗脱速度。结果见图5:洗脱液吸光度值A最大效果最佳，即最佳流速为2ml/min。洗脱时，流速不仅影响GSH的洗脱效果，还会影响洗脱体积。洗脱太慢，洗脱液体积大，耗时长;洗脱快，GSH洗脱率低，损耗大。

图5 不同流速对GSH洗脱的影响

2.6洗脱液的选择分别选用0.1M冰醋酸、0.35M冰醋酸，0.1M NaOH、0.2M NaOH，0.3M醋 酸 钠+0.1M NaOH作为洗脱剂，检测洗脱液中GSH的含量，并计算GSH的回收率。结果见表1:用冰醋酸洗脱时体积较大，冻干繁琐，时间长。因此，选择洗脱体积小且回收率高的0.2M NaOH洗脱，且GSH能集中洗脱下来，所含杂质较少。

表1 不同试剂洗脱对GSH回收率的影响

2.7洗脱终点的判断采用亚硝基铁氰化钠法检测，取一滴洗脱液，滴入1.5%亚硝基铁氰化钠溶液(饱和硫酸铵溶液配制)，观察颜色变化，如果颜色变为红色，表明还未洗脱完全，反之，则洗脱液中无GSH存在，停止洗脱。

2.8GSH的测定采用HPLC法测定GSH的纯度，选用C18柱，流动相:缓冲液A:0.1%TFA,H2O，缓冲液B:0.1%TFA，CH3CN，恒度洗脱，A:B=95:5(体积比);流速:0.8ml/min，测波长:214nm。结果显示样品出峰时间与标准品比较，时间基本一致，初步确定产品为GSH，所得产品的HPLC纯度为37.55%。

2.9001×7阳离子交换树脂对GSH的分离纯化重复扩大实验结果在25℃、4000r/min的条件下利用超滤膜除去大分子蛋白，上柱最适宜pH=3，洗脱液为0.2M NaOH，洗脱流速为2.0ml/min，进行重复扩大实验。果见表2，GSH的平均回收率为73.94%。

表2　001×7阳离子交换树脂对GSH的分离纯化重复扩大实验结果

3 小结

采用001×7阳离子交换树脂和超滤膜结合的方法分离纯化GSH，结果显示此方法可行，可为GSH的进一步扩大生产提供实验数据。根据实验结果确定在25℃、4000r/min的条件下利用超滤膜除去大分子蛋白，上柱最适宜pH值为3洗脱液为0.2M NaOH，洗脱流速为2.0ml/min，产品GSH的纯度为37.55%。

[1]王大慧,卫功元.谷胱甘肽的应用前景及生产研究现状[J].化学与生物工程,2004,(3):10-12.

[2]周宇光,付国平,肖仔君.谷胱甘肽的生产和应用研究进展[J].食品工业科技,2003,(3):89-91.

[3]邱雁临,胡静,缪谨枫,等.利用大孔树脂从啤酒废酵母中分离谷胱甘肽[J].吉首大学学报,2008,29(1):83-86.

[4]樊文玲,詹秀琴,林瑛.超滤膜分离地龙匀浆液中蛋白物质的操作条件优化研究[J].中成药，2007，29(11):1598-1601.

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1004-6879(2014)03-0239-03

2013-10-16)