祖师麻多糖提取工艺及体外抗氧化活性的研究

孙雪萍，徐 艳，杨家林（广西海洋研究所海洋生物技术重点实验室，广西北海536000）

祖师麻多糖提取工艺及体外抗氧化活性的研究

孙雪萍，徐 艳，杨家林
（广西海洋研究所海洋生物技术重点实验室，广西北海536000）

目的：优选祖师麻多糖的最佳提取工艺，对其单糖组成进行分析，并对其体外抗氧化活性进行研究。方法：采用正交实验法，以多糖得率为指标，对祖师麻多糖的提取工艺进行优选。采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色谱法对其单糖组成进行分析。采用比色法，测定了祖师麻多糖对DPPH自由基和羟基自由基的清除能力，还原能力以及总体抗氧化能力。结果：祖师麻多糖的最佳提取工艺为15倍量水，100℃提取3次，每次2h；单糖组成分析表明祖师麻多糖主要含有甘露糖，氨基葡萄糖，葡萄糖，半乳糖和岩藻糖；祖师麻多糖显示出较强的DPPH自由基清除能力，还原能力和总体抗氧化能力，以及中等强度的羟基自由基清除能力。结论：优选的提取工艺稳定可靠，祖师麻多糖具有较强的抗氧化活性。

祖师麻多糖，提取工艺，正交实验，单糖组成，抗氧化

祖师麻为瑞香科植物黄瑞香Daphne giraldii Nitsche.陕甘瑞香Daphne tangutica Maxim.或Daphne retusa Hemsl.的干燥茎皮和根皮，具有祛风除湿，活血通络之功效，临床多用于风湿痹痛、关节炎，类风湿性关节痛等。现代药理学研究表明，祖师麻具有镇痛、抗炎、抗血栓、中枢神经抑制、抑菌等药理活性[1-2]。化学成分研究表明，祖师麻主要含有香豆素类、二萜类、木质素类、黄酮类、蒽醌类及甾醇类等化学成分[3-4]。近年来国内外学者对祖师麻的研究主要集中在其脂溶性成分，而对其多糖的研究较少，有关祖师麻多糖的结构研究更是未见报道。本研究采用正交实验法，确定祖师麻多糖的最佳提取工艺，并在此基础上，采用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生高效液相色谱法对其多糖的单糖组成进行分析，并对其体外抗氧化活性进行了研究，以期为祖师麻多糖的分离纯化及药理活性的研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

祖师麻药材 购自安徽亳州药材市场，经山东中医药大学周凤琴教授鉴定为瑞香科植物Daphne giraldii Nitsche.的干燥根皮；DPPH（二苯代苦味酰基）、BHT（二丁基羟基甲苯）、甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖标准品 购自Sigma-Aldrich（Sigma公司，美国）；色谱纯乙腈 购自Fisher Scientific（Fisher公司，美国）；其余试剂 均为分析纯。

RE 52-99旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；SHB-Ⅲ循环水式真空泵 郑州长城科工贸有限公；DK-S26电热恒温水浴锅 上海精宏实验设备有限公司；FA1004N电子分析天平 上海精密科学仪器有限公司；Agilent 1260 Infinity HPLC安捷伦高效液相色谱仪。

1.2 实验方法

1.2.1 祖师麻多糖的提取工艺 称取10.0g干燥的祖师麻药材（含水量为9.3%），粉碎过10目筛，用10倍量95%乙醇浸泡静置24h，加热回流提取2次，每次30min，抽滤，弃去上清液，取沉淀将乙醇挥干。将回流后的总沉淀收集，按照正交实验设定的参数加入一定量蒸馏水（料液比），在设定的不同温度（提取温度）下加热提取一定时间（提取次数、提取时间），过滤，合并提取液，旋转蒸发仪65℃减压浓缩至原体积的1/4，加入4倍量的无水乙醇醇沉，充分搅拌后4℃放置24h，抽滤，沉淀依次用无水乙醇，丙酮清洗，60℃真空干燥得到祖师麻多糖（DGP）。

1.2.2 祖师麻多糖得率的测定 采用重量法测定祖师麻多糖的得率，将1.2.1中真空干燥的DGP置于分析电子天平称重，按照下式计算祖师麻多糖得率。

多糖得率（%）=多糖质量（g）/祖师麻药材质量（g）×100

1.2.3 提取工艺的优选 分别取祖师麻药材10.0g，根据文献研究和前期预实验结果，选择料液比（A祖师麻药材与水的质量比），提取时间（B，h），提取次数（C），提取温度（D，℃）为考察因素，选用L9（34）正交实验进行提取工艺的优选[5]。正交实验因素水平见表1。

表1 正交实验因素水平表Table 1 Design for factors and levels of orthogonal experiment

1.2.4 总糖、硫酸基、糖醛酸和蛋白质含量的测定 采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖为标准品测定祖师麻粗多糖的总糖含量[6]，采用硫酸钡-明胶比浊法，以经过五氧化二磷干燥的硫酸钾为标准品测定硫酸基含量[6]，采用硫酸咔唑法，以葡萄糖醛酸为标准品测定糖醛酸含量[6]，采用Folin酚法，以牛血清蛋白为标准品测定蛋白质含量[6]。

1.2.5 单糖组成分析

1.2.5.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZOBAX-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：磷酸盐缓冲液（pH6.7）/CH3CN（83∶17，V/V）；流速：1.0mL/min；柱温：25℃；进样量：10μL；检测器：DAD（245nm）。

1.2.5.2 标准品衍生条件 取10种单糖标准品（甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖）各1mg，加入100μL 0.3mol/L NaOH溶液，120μL 0.5mol/L 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）溶液，70℃衍生1h，氯仿萃取后采用高效液相色谱分析[7]。

1.2.5.3 样品单糖组成测定 取祖师麻多糖3mg，用2mol/L三氟乙酸在110℃进行全水解6h，反复加甲醇旋转蒸发除去三氟乙酸至无酸味，与标准品在相同条件下衍生，进样10μL，高效液相色谱分析，记录色谱图。与各单糖标准品的出峰时间对照，确定样品单糖组成。

1.2.6 体外抗氧化活性的测定

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力的测定 DPPH溶液的配制：准确称取4mg DPPH，用甲醇溶解并定容于100mL容量瓶中，DPPH浓度为0.004%，避光保存（0～4℃）。取样品液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL（不足体积用相应的空白溶剂补齐至1.0mL）与4mL 0.004%DPPH溶液加入同一试管中，摇匀，在黑暗中放置30min，以相应空白溶剂为空白在517nm测定其吸光度A，计算其清除率，阳性对照为BHT[8]。

清除率（%）=[（A0－A1）/A0]×100

式中：A0—1mL空白溶剂加4.0mL DPPH溶液的

吸光度，A1—待测液加4.0mL DPPH溶液的吸光度。1.2.6.2 羟基自由基清除能力的测定 利用H2O2与Fe2+混合产生羟基自由基，在体系内加入水杨酸捕捉自由基并产生有色物质。该物质在510nm下具有最大吸收。反应体系中含有8.8mmol/L的H2O21mL，9mmol/L的FeSO41mL，9mmol/L的水杨酸-乙醇各1mL，不同浓度的样品溶液1mL，最后加入H2O2启动反应，37℃反应30min，以超纯水为参比，在510nm下测量各浓度的吸光度。考虑到样品本身的吸光值，以9mmol/L FeSO41mL、9mmol/L的水杨酸-乙醇1mL、不同浓度的样品溶液1mL和蒸馏水1mL作为样品的本底吸收值。按照下试计算其清除率（%），阳性对照为BHT[9]。

清除率（%）=[A0－（Ax－Ax0）]/A0×100

式中：A0—空白对照液的吸光度，Ax—加入样品溶液的吸光度，Ax0—不加显色剂H2O2样品溶液本底的吸光度。

1.2.6.3 还原能力的测定 在试管分别加入不同浓度的被测溶液1.0mL。磷酸盐缓冲溶液（0.2mol/L pH=6.6）2.5mL和1%铁氰化钾2.5mL，置于50℃电热恒温水浴锅中反应20min，然后加入10%的三氯乙酸2.5mL，摇匀，离心。吸取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸馏水和0.5mL 0.1%的三氯化铁溶液，测定样品在700nm处测定吸光值，阳性对照为BHT[10]。

1.2.6.4 总体抗氧化能力的测定 0.1mL的提取物与1mL的试剂溶液P溶液（含有0.6mol/L硫酸，28mmol/L磷酸钠，4mmol/L钼酸铵）混合，95℃反应90min，待试管冷却到室温后，695nm下比色，以抗坏血酸比较[11]。

2 结果与分析

2.1 正交实验结果分析

表2 正交实验结果表Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析表Table 3 Variance of orthogonal experiment

以多糖得率为指标，按照L9（34）正交实验进行实验，结果见表2。

根据正交实验直观分析和方差分析结果可知（表2和表3），4个因素极差值R大小顺序为A＞C＞D＞B，对祖师麻多糖提取得率的影响因素依次为料液比＞提取次数＞提取温度＞提取时间，其中料液比与提取次数对祖师麻多糖得率具有显著性影响。根据直观分析结果，祖师麻多糖的最优提取工艺为A2B3C3D3，即加15倍量水，100℃搅拌提取3次，每次2h。根据优选的最佳工艺，进行验证实验，祖师麻多糖的得率为3.87%±0.27%。

2.2 单糖组成分析

复方水相中总糖含量为62.25%，蛋白含量为5.51%，糖醛酸含量为15.18%，未检测到硫酸根。单糖组成分析结果表明祖师麻多糖主要含有甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖（图1）。

2.3 体外抗氧化活性

2.3.1 DGP对DPPH自由基的清除作用 DPPH自由基是一种稳定的有机自由基，其溶液具有特征的紫红色团吸收峰，当存在自由基清除剂时，由于与其单电子配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其所接受的电子数成定量关系，因而可用分光法进行定量分析，目前以分光光度法测定加入不同浓度的抗氧化剂或待测样品后吸光度的分析方法是一种筛选自由基清除剂的常用方法[12]。由图2可知，随着浓度的不断增加，DGP对DPPH·的清除率逐渐上升，呈现明显的量效关系。当DGP浓度为0.4mg/mL时，其对DPPH·自由基的清除率达到21.44%高于同浓度下BHT的15.4%。当DGP浓度为2mg/mL时，其清除率为57.78%，低于同浓度下BHT的76.98%，但是总体来看，DGP（IC50=1.22mg/mL）与BHT（IC50=0.97mg/mL）的DPPH自由基清除能力相差不大，因此DGP具有显著的DPPH自由基清除作用。

图1 祖师麻多糖单糖组成分析Fig.1 HPLC analysis of monosaccharide composition in DGP

图2 DGP对DPPH自由基的清除能力（±s，n=3）Fig.2 Scavenging effect of DGP on DPPH free radicals（±s，n=3）

2.3.2 DGP对羟基自由基的清除作用 羟基自由基是一类化学性质非常活泼的自由基，可损伤蛋白质、核酸、脂质等多种生物大分子，尤其是对脂质过氧化的作用最强。因此羟基自由基清除作用被认为是抗氧化活性的重要指标[13]。由图3可知，在0～2.0mg/mL的浓度范围内，随着DGP浓度的增加，清除羟基自由基的作用逐渐增强，且呈现良好的量效关系，但是与BHT相比清除作用仍然比较弱。虽然在清除羟基自由基能力上低于BHT，但是在一定的测试范围内，DGP仍然表现出一定的抗氧化活性。

图3 DGP对羟基自由基的清除能力（±s，n=3）Fig.3 Scavenging effect of DGP on hydroxyl free radicals（±s，n=3）

2.3.3 DGP的还原能力 样品的还原能力与抗氧化活性有明显相关性。抗氧化剂通过自身的还原作用给出电子从而清除自由基。还原能力越强，抗氧化性越强。通常采用铁氰化钾氧化样品来表征还原力，体系中Fe3+，在抗氧化剂的促进下变成Fe2+，形成的Fe2+在700nm处有吸收。最终检测吸光值越大，还原力越强。因此，一种物质的还原力可作为考察潜在其抗氧化能力的重要指标[13]。由图4可知，DGP的还原能力随着浓度的增加而增大，但量效关系表现一般。在0～0.8mg/mL的浓度范围内，祖师麻多糖的还原能力要强于BHT。在浓度为1.0mg/mL时，吸光度达到0.501。

图4 DGP的还原能力（±s，n=3）Fig.4 Reducing power of DGP（±s，n=3）

2.3.4 总体抗氧化活性 总体抗氧化活性常用于定量换算抗氧化剂的能力。由图5可知，以抗坏血酸作为对照，DGP的总体抗氧化能力相当于抗坏血酸的50%。上述四个实验结果表明祖师麻多糖具有较强的体外抗氧化活性。

图5 DGP的总体抗氧化能力（±s，n=3）Fig.5 Total antioxidant activity of DGP（±s，n=3）

近年来我国对植物多糖的研究日益广泛，已有报道表明很多植物多糖具有抗癌、抗衰老等功能，而这些功能主要又与多糖的抗氧化作用有关，因此植物多糖的抗氧化作用可以用于多种生物活性的初步评价。本研究结果表明DGP具有显著的DPPH自由基清除能力，一定的羟基自由基清除能力，较强的还原能力和总体抗氧化能力。结合前期的药效学研究结果，提示祖师麻多糖作为抗氧化功能因子在保健食品与临床应用中具有较大的前瞻性，应用前景乐观。临床研究表明氧化应激可以导致炎症的发生和发展，在这一过程中活性氧自由基一方面破坏病原菌和病变细胞，另一方面又进攻白细胞造成其大量死亡，结果引起溶酶体酶的大量释放而进一步杀伤或杀死组织细胞，造成骨、软骨的破坏而导致炎症和关节炎。祖师麻作为一种治疗疼痛、跌打损伤、风湿性关节炎和支气管炎的常用植物药，其多糖的抗氧化作用很可能是其抗炎作用的有效作用途径之一。

3 结论

本研究通过正交实验优选祖师麻多糖的提取工艺，最佳提取工艺为15倍量水，100℃提取3次，每次2h；单糖组成分析结果表明祖师麻多糖主要含有甘露糖、氨基葡萄糖、葡萄糖、半乳糖和岩藻糖；抗氧化研究表明，祖师麻多糖具有显著的DPPH自由基清除能力，其IC50为1.22mg/mL与BHT相差不大；祖师麻多糖具有一定强度的羟基自由基清除能力，但是与BHT相比有一定差距；祖师麻多糖也显示出较强的还原能力，其总体抗氧化能力约为抗坏血酸的50%。本研究为祖师麻多糖的后期开发提供了理论依据，同时其结构及构效关系方面的研究有待于进一步开展。

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Study on the extraction process of crude polysaccharide from Daphne giraldii and its antioxidant activity in vitro

SUN Xue-ping，XU Yan，YANG Jia-lin
（Guangxi Institute of Oceanology，Beihai 536000，China）

Objective：To optimize the extraction process of crude polysaccharide from Daphne giraldii Nitsche（DGP）and analyze its monosaccharide composition，and investigate its antioxidant activity in vitro.Methods：Using the polysaccharide yield as the index，orthogonal design experiment was employed to optimize the extraction process.1-phenyl-3-methy-5-pyrazolone precolumn derivatization high performance liquid chromatography（PMP-HPLC）method was used to analyze the monosaccharide composition.Antioxidant properties of DGP were evaluated by different antioxidant tests，including DPPH free radical scavenging activity，hydroxyl radical scavenging activity，reducing power and assay of total antioxidant activity in different chemical simulated systems with colorimetry method.Results：The optimum extraction process was added 15 times amount of water for 3 times，and 2 hours for each time at 100℃.Monosaccharide composition analysis indicated that DGP was mainly composed of mannose，glucosamine，glucose，galactose and fucose.DGP possessed potential DPPH free radical scavenging activity，and moderate hydroxyl free radical scavenging activity.It also exhibited some functions of reducing power and total antioxidant.Conclusion：The optimum extraction process was stable.DGP could be applied to as a potential natural antioxidant.

polysaccharide from Daphne giraldii Nitsche；extraction process；orthogonal test；monosaccharide composition；antioxidant

TS201.2

B

1002-0306（2014）12-0268-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.12.050

2013－09－23

孙雪萍（1982-），女，博士，助理研究员，研究方向：天然产物化学。

广西科学研究与技术开发计划项目（桂科攻11107011-8）；广西科学院基本科研业务费资助项目（13YJ22HYS15）；广西科学研究与技术开发计划（桂科攻11107011-6）。