巨噬细胞对肝癌细胞株侵袭能力的影响

李 焱,陈 石,魏 东,程 朋,彭晶晶,赵振国,谭 勇

巨噬细胞是人体重要的免疫细胞,通过直接吞噬或抗原呈递来参与机体免疫反应。既往研究发现,巨噬细胞可通过直接杀伤肿瘤细胞,或通过呈递肿瘤相关抗原诱导机体免疫应答来清除肿瘤细胞。同时另有一些研究发现,巨噬细胞可促进肿瘤细胞生长、侵袭和转移[1]。本实验拟通过研究巨噬细胞与肝癌细胞的相互作用,揭示巨噬细胞对肝癌细胞侵袭能力的影响,并探讨可能的机制。

1 材料与方法

1.1材料 人肝癌细胞株SMMC7721及人单核/巨噬细胞株THP-1均购自上海中科院细胞库；胎牛血清(FBS)、细胞培养基RPMI 1640、DMEM、胰蛋白酶、Hank平衡液为GIBCO公司产品；佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(PMA)为Sigma公司产品；Transwell迁移小室、Matrigel基质胶为BD公司产品；MMP-9 ELISA试剂盒为R&D公司产品。

1.2方法

1.2.1细胞培养及分化诱导 将THP-1细胞株接种于含有150 ml/L FBS的RPMI 1640培养基中,待细胞增殖至对数生长期时收集,以1×109个/L接种于培养瓶中,加入200 nmol/L的PMA作用24 h。

1.2.2活化的巨噬细胞与肝癌细胞共培养系统的建立 参考章必成等[2]方法,选择迁移小室和24孔培养板建立Transwell共培养系统。首先在下室内接种含1×104个处于对数生长期的SMMC7721细胞,4 h后实验组在上室内接种活化的THP-1细胞(1×104个),然后共培养。根据上室内的细胞类型分为对照组(未接种任何细胞)和实验组(接种活化的THP-1细胞)。

1.2.3Transwell侵袭模型检测肝癌细胞侵袭能力 将侵袭小室放入灭菌的24孔板中,其中侵袭小室内铺Matrigel基质胶。培养板中分别加入实验组和对照组的培养液上清各1 ml。将1×104个肝癌细胞接种于迁移小室中,孵育箱中培育24 h后取出,用棉签擦去内表面的基质胶和细胞。将其置入95%乙醇中固定10 min,行HE染色。显微镜下计数膜背面的细胞数目。每个样本计数5个视野,取平均值进行比较。

1.2.4MMP-9检测 MMP-9检测按试剂盒说明进行。取实验组和对照组的细胞培养液各12份,与稀释液混合,孵育2 h,缓冲液清洗,依次加入结合物、底物、终止液,用酶标仪检测结果。

2 结果

2.1两组肝癌细胞侵袭能力的比较 在细胞培养基趋化作用下,对照组和实验组肝癌细胞穿过Transwell小室的细胞数分别为40.2±7.1和61.2±13.8,对照组显著多于实验组(t=3.022,P=0.017)。

2.2两组MMP-9水平的比较 两组培养体系中,MMP-9水平分别是,实验组(353.58±55.07)ng/ml,对照组(308.37±34.48)ng/ml,实验组显著高于对照组(t=2.411,P=0.025)。

3 讨论

肿瘤与炎症的联系已被流行病学调查所证实,一方面慢性炎症可以诱发肿瘤,与炎症相关的肿瘤约占15%左右[3],肝癌就是其中的典型。另一方面肿瘤细胞和间质细胞可产生大量的炎症因子,在肿瘤局部微环境中产生一系列的生物学效应,诸如促进血管、淋巴管生成；抑制局部免疫反应和免疫监视,形成免疫逃逸；破坏细胞基质,促进侵袭转移等等。而肿瘤局部微环境中的炎症因子可趋化大量的巨噬细胞聚集。Takanami等[4]研究113例肺腺癌患者手术标本中巨噬细胞浸润的密度,发现巨噬细胞是独立的预后因素,高密度巨噬细胞浸润的患者预后较差。

细胞外基质是肿瘤细胞侵袭转移的主要屏障,基质的降解与肿瘤的侵袭转移密切相关。金属基质蛋白酶是目前发现的参与基质降解的主要因子[5]。在肝癌相关研究中有报道,肿瘤基质中金属基质蛋白酶的表达水平是肝癌术后复发的预测因素之一[6]。

巨噬细胞可分泌包括金属蛋白酶在内的多种基质水解酶,还可分泌一些因子作为金属基质蛋白酶的活化剂,参与细胞外基质的破坏。Hagemann等[7]报道,将巨噬细胞和卵巢癌细胞共培养后,可上调肿瘤细胞和巨噬细胞的基质金属蛋白酶表达。Hiraoka等[8]在使用特异性巨噬细胞清除剂后,明显抑制了肺癌转移的发生。研究者分析原因,认为巨噬细胞在肿瘤局部的趋化因子的诱导下,进入肿瘤组织并分泌多种基质水解酶；同时细胞外基质的分解产物又与肿瘤细胞及巨噬细胞表面的Toll样受体结合,逆向激活一系列活性细胞因子的表达(含金属基质蛋白酶的表达)[9-10]。本研究通过模拟肿瘤微环境中巨噬细胞与肿瘤细胞的相互作用,也看到了类似现象,在肿瘤细胞与巨噬细胞共培养的体系中,肿瘤细胞的侵袭能力得到增强,并且与金属基质蛋白酶的表达增高有关。

因此,更深入地研究巨噬细胞促进肿瘤发生、发展的机制,并将这些机制应用于巨噬细胞在肿瘤浸润转移中的研究,将为肿瘤的治疗提供新的方法。

【参考文献】

[1] Lewis CE,Pollard JW.Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments[J].Cancer Res,2006,66(2):605-612.

[2] 章必成,王俊,赵勇,等.不同活化表型的巨噬细胞对Lewis肺癌细胞增殖和侵袭的影响[J].第三军医大学学报,2007,29(11):1013-1016.

[3] Allavena P,Garlanda C,Borrello MG.Pathways connecting inflam-mation and cancer[J].Curr Opin Gene Dev,2008,18(1):3-10.

[4] Takanami I,Takeuchi K,Kodaira S.Tumor-associated macrophage infiltration in pulmonary adenocarcinoma:association with angiogenesis and poor prognosis[J].Oncology,1999,57(2):138-142.

[5] Vasiljeva O,Papazoglou A,Kruger A,et al.Tumor cell-derived and macrophage-derived cathepsin B promotes progression and lung metastasis of mammary cancer[J].Cancer Res,2006,66(10):5242-5250.

[6] Zhang Q,Chen X,Zhou J,et al.CD147,MMP-2,MMP-9 and MVD-CD34 are significant predictors of recurrence after liver transplantation in hepatocellular carcinoma patients[J].Cancer Biol Ther,2006,5(7):808-814.

[7] Hagemann T,Hagemann T,Wilson J,et al.Macrophages induce invasiveness of epithelial cancer cells via NF-κB and JNK[J].J Immunol,2005,175:1197-1205.

[8] Hiraoka K,Zenmyo M,Watari K,et al.Inhibition of bone and muscle metastases of lung cancer cells by a decrease in the number of monocytes/macrophages[J].Cancer Sci,2008,99(8):1595-1602.

[9] Tsan MF,Gao B.Endogenous ligands of Toll-like receptors[J].J Leukoc Biol,2004,76(3):514-519.

[10] Kawamura T,Murakami K,Bujo H,et al.Matrix metallo-proteinase-3 enhances the free fatty acids-induced VEGF expression in adipocytes through Toll-like receptor 2[J].Exp Biol Med,2008,233(10):1213-1221.