DAD-HPLC法同时测定姜中黄酮类物质

李田叶，翟龙飞，李 岩，郭 露，王向红，2，*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定 071001；2.河北省农产品加工工程技术研究中心，河北保定 071001）

DAD-HPLC法同时测定姜中黄酮类物质

李田叶1，翟龙飞1，李 岩1，郭 露1，王向红1，2，*

（1.河北农业大学食品科技学院，河北保定 071001；2.河北省农产品加工工程技术研究中心，河北保定 071001）

姜具有丰富的营养价值和药用保健功效，也是重要的调味料，具有很大的开发前景。应用二极管阵列高效液相色谱法对姜中黄酮类物质进行了分析，色谱条件为：以HYPERSIR C18BDS为固定相，流动相A甲醇，流动相B 0.1%甲酸水为流动相，采用梯度洗脱，流速0.8mL/min，柱温为30℃，检测波长270nm和370nm。在0~125mg/L范围内八种黄酮类物质在线性范围内均具有良好的线性关系。结果表明，DAO-HPLC法简便，灵敏，重现性好，可有效的用于姜及姜制品中黄酮类物质含量的测定。

高效液相色谱法，姜，没食子酸，芦丁，槲皮素

姜（ginger），古 名 薑 ，别 名 生 姜 、黄 姜 ，为 姜 科（Zingiberaceae）多年生草本植物。姜含有丰富的营养物质，除基本营养成分之外，还含有姜辣素、姜油酮、姜烯酚、姜醇等特殊成分[1-3]，在医学上又是广泛应用于临床的传统中药，可治疗风寒感冒等病症，其药用历史悠久，还是我国城乡人民所喜食的重要调味佐料[4-7]，种植范围广[1]。但是根据文献报道，姜的研究主要集中在姜精油、姜辣素的利用[2-3]。

黄酮类化合物具有多种生物活性，除具有抗菌、消炎、抗突变、降压、清热解毒、镇静、利尿等作用外，在抗氧化、抗癌、防癌、抑制脂肪酶等方面也有显著效果，是一种重要的具有开发前景的天然有机抗氧化剂[8]，在药 品 及 食品 的 开发 应用中 越 来 越 受到 关 注 。对于黄酮类成分含量的测定方法已经成熟，在植物果实、根、茎叶中都有很多的文献报道[9-13]，但未看到有关姜中总黄酮以及黄酮类物质的分析，如何对姜的黄酮类物质进行高值化、资源化、生态化利用，以更好的发挥姜的功效，是很有意义和价值的内容。本实验拟采用二极管阵列高效液相色谱法同时分离八种黄酮类物质，并对姜样品进行测定，为建立不同种类黄酮类物质同时测定提供高效、快速、灵敏、准确的分析方法，并对姜产品的高效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生姜 保定市南郊果蔬批发市场提供；没食子酸标准品、儿茶素标准品、木犀草素标准品、芦丁标准品、杨梅素标准品、异鼠李素标准品、槲皮素标准品、山奈酚标准品 中国药品检验鉴定所提供；甲醇 为色谱纯；水 是乐百氏纯净水；其余试剂 均为分析纯。

Agilent 1200型高效液相色谱仪 美国安捷伦有限公司；UV-2800H型紫外可见分光光度计 尤尼科（上海）仪器有限公司；电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；KQ-500DE型数控超声波清洗器昆山市超声仪器有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；FZG-4A型真空干燥箱 南京天利制药设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 姜样品制备 原料挑选→清洗、切片→60~80℃真空干燥→粉碎→保存。

1.2.1.1 原料挑选 选用新鲜的生姜，避免选择受到较多机械损伤或其他伤害的原料。

1.2.1.2 清洗、切片 用水清洗干净杂质，去掉表皮和受到伤害的部位。切片厚度应尽量均匀一致，本实验采用的是切片厚度为2mm。

1.2.1.3 真空干燥 采用60~80℃的温度在真空干燥箱干燥，干燥时间以姜片的水分含量不高于12%为依据。

1.2.1.4 粉碎、筛分 粉碎过程中应避免局部高温而影响制的姜粉的质量。筛分时采用60目筛筛分。

1.2.1.5 保存 室温放在干燥器中保存备用。

1.2.2 溶液的制备

1.2.2.1 提取溶剂和提取方法的选择 本实验通过对75%甲醇、水、甲醇作为提取溶剂的比较，同时采用加热回流提取、超声提取和索氏提取法的比较的提取效果，来确定合适的提取溶剂和提取方法。

1.2.2.2 对照品溶液的制备 由于关于姜中黄酮类物质的研究内容很少，选取植物中常见的八种黄酮：没食子酸、儿茶素、木犀草素、芦丁、杨梅素、异鼠李素、槲皮素、山奈酚进行研究。

因此，精密称取没食子酸、儿茶素、木犀草素、芦丁、杨梅素、异鼠李素、槲皮素、山奈酚的对照品适量溶于色谱醇甲醇制得1.0mg/mL的单标对照品溶液备用。使用时精密吸取单标对照品贮备溶液适量制得混标对照品溶液。

1.2.2.3 样品溶液的制备 精密称取姜干燥后姜粉约1.0g，加入40mL甲醇，超声处理40min，取上清液3500r/min离心5min，将离心后的上清液，移入梨形瓶中，将残渣重复操作一次，合并离心液旋转蒸发至干，加入1mL提取溶剂回溶，用有机微孔滤膜（0.45μm）过滤，作为供试品溶液。

1.2.3 色谱条件的确定

1.2.3.1 色 谱 柱 的 选 择 通 过 比 较 HYPERSIR C18BDS（5μm × 250mm × 4.6mm）、Wondasil C18（5μm × 250mm×4.6mm）、Symmetry C18（5μm×250mm×4.6mm）的分离度、峰对称性和拖尾因子来衡量两峰的分离效果，来选择本实验所用色谱柱。

1.2.3.2 流动相的选择 本实验通过比较甲醇和水组合流动相以及乙腈和水组合流动相的测定结果的分析，同时考虑到经济成本，选择合适的流动相。

在确定梯度洗脱的梯度程序时，利用高效液相色谱仪，分别选择不同的流动相比例来调节梯度，要求保证峰形好且出峰时间较快，使之既能达到基线分离的要求，又有适宜的保留时间。经过对混标以及姜样品的色谱图的分析来综合考虑来确定合适的梯度。

1.2.3.3 流速的确定 本实验考察了流速对保留时间及分离效果的影响：

经色谱图分析可知在0.6~1.0mL/min之间，样品均能达到基线分离。本实验分别设定采用0.6、0.8、1.0mL/min的流速来比较色谱峰的重叠性，分离度，并要考虑到样品分析中杂质的干扰，来选择合适的流速。

1.2.3.4 检测波长的确定 通过高效液相色谱仪对植物中常见的八种黄酮类物质进行全波长扫描，确定单黄酮的最大吸收波长，综合光谱分析结果及文献选择合适的检测波长[9-13]。

1.2.4 黄酮类物质线性关系的确定 取上述标准品适量，以色谱醇甲醇分别稀释成浓度为1、5、10、12.5、25、50、100、125μg/mL的溶液，按上述色谱条件分别取10μL进样测定。以峰面积积分值（Y）为纵坐标，标准品溶液的浓度（X）为横坐标，进行线性回归分析。

1.2.5 精密度实验 取混标100μg/mL、进样6次，每次进样10μL，记录峰面积，分别计算没食子酸、儿茶素、木犀草素、芦丁、杨梅素、异鼠李素、槲皮素、山奈酚的峰面积的RSD。

1.2.6 稳定性实验 取同一姜样品溶液，按“1.2.3.3”方法制备供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样10μL测定，考察其稳定性并记录峰面积，分别计算没食子酸、儿茶素、木犀草素、芦丁、杨梅素、异鼠李素、槲皮素、山奈酚的峰面积的RSD。

1.2.7 加标回收率实验 称取已知含量的样品6份，每份约1g，准确计算样品中黄酮类物质的含量并分别加入适量的单标对照品溶液，按“1.2.2.3”方法制备供试品溶液，进样分析。

1.3 数据处理

精密称取此批次共3份姜粉末各1.0g，分别按“1.2.2.3”方法制备供试品溶液，经过对不同提取溶剂和提取方法的选择，并在样品过膜后利用高效液相色谱仪使用测定好的色谱条件来测定样品含量。

2 结果与分析

2.1 提取条件的最终确定

本实验比较了75%甲醇、水、甲醇作为提取溶剂的提取效果，通过比较发现由于杨梅素等黄酮类物质在水中的溶解性不高，因此通过高效液相色谱分析发现对姜中所含的黄酮类物质的提取率并不高；用甲醇做提取溶剂发现纯甲醇做提取溶剂明显高于75%的甲醇的提取含量。确定好甲醇作为提取溶剂之后，比较了加热回流提取、超声提取和索氏提取法三种方法的提取效果，发现这三种提取方法对姜中黄酮类物质的提取率是加热回流提取法＜索氏提取法＜超声提取法，并且超声提取法的提取率明显高于其余两种方法，而且操作简便省时。最终确定甲醇作为提取溶剂，超声提取法作为提取方法。

2.2 色谱条件的最终确定

2.2.1 色 谱 柱 的 选 择 比 较 HYPERSIR C18BDS（5μm×250mm ×4.6mm）、Wondasil C18（5μm×250mm × 4.6mm）、Symmetry C18（5μm ×250mm ×4.6mm）的 分 离度、峰对称性和拖尾因子，衡量两峰的分离效果，通过实验发现HYPERSIR C18BDS（5μm×250mm×4.6mm）分 离 效 果 最 好 ，柱 效 最 高 ，故 确 定 HYPERSIR C18BDS（5μm×250mm×4.6mm）为本实验的色谱柱。

2.2.2 流动相的选择 通过比较甲醇和水组合流动相以及乙腈和水组合流动相的测定结果的分析，发现甲醇和水组合测定时的分离效果更好；在改善峰形，消除拖尾，色谱峰重现性以及对柱子的维护等方面来考虑时，甲酸比磷酸对柱子更加温和，同时能够很好的改善峰形，消除拖尾，故加入甲酸，最终确定流动相组合为甲醇和0.1%甲酸水。

2.2.3 流动相梯度的选择 在确定梯度洗脱的梯度程序时，利用高效液相色谱仪，通过尝试不同的流动相比例来调梯度，经多次实验发现表1所示梯度既能保证峰形好且出峰时间较快，使之既能达到基线分离的要求，又有适宜的保留时间，在23min内在色谱图上就把八种黄酮全部出峰完毕，并且分离的很好。同时样品也分离的很好，最终确定了合适的梯度。

2.2.4 流速的选择 分别设定比较0.6、0.8、1.0mL/min的流速，经色谱图分析可知三种流速相比，0.8mL/min的流速有较好的分离度，同时在样品分析中杂质干扰较少，故最终确定流速为0.8mL/min。

2.2.5 检测波长的选择 根据高效液相色谱仪的检测器进行的全波长扫描分析可知没食子酸、儿茶素、杨梅素、芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素的最大吸收波长各不相同。其中没食子酸、儿茶素、杨梅素最大吸收波长大约为270nm，芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素的最大吸收波长大约为370nm，由于八种成分的最大吸收波长相差较大，在任意一种检测波长下均无法得到灵敏度高、谱峰面积较大、分离良好且无干扰的色谱图。检测波长越短，基线漂移及干扰越严重。检测波长太大时，也不能准确的定性定量分析，故采用双波长检测模式进行检测。在270nm下，分离没食子酸、儿茶素、杨梅素；在370nm下分离芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素。色谱图见图1、图2。姜样品图见图3、图4。

优化后得到的色谱条件为：

色 谱 柱 ：HYPERSIR C18BDS（5μm × 250mm × 4.6mm）；流动相：流动相A 甲醇、流动相B 0.1%甲酸水，流动相梯度见表1；流速：0.8mL/min；检测波长：270、370nm；柱温：30℃；进样量：10μL。分别取对照品溶液和样品溶液各10μL进行液相色谱仪分析。

图1 混标标准品270nm波长下色谱图Fig.1 Under standard 270nm wavelength mixed standard chromatogram

图2 混标标准品370nm波长下色谱图Fig.2 Under standard 370nm wavelength mixed standard chromatogram

图3 姜270nm波长下色谱图Fig.3 Under standard 270nm wavelength ginger chromatogram

图4 姜370nm波长下色谱图Fig.4 Under standard 370nm wavelength ginger chromatogram

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of mobile phase

表2 线性关系及最低检测限结果（n=6）Table 2 Linear relationship and the result of the minimum detection limit（n=6）

表3 精密度实验结果（n=6）Table 3 Precision of test results（n=6）

2.3 线性关系考察及最低检测限的检出

经过高效液相色谱法分析，对八种黄酮的线性关系和最低检测限分别进行分析计算，得到结果如表2所示。

通过对表2分析可知，在0~125mg/L范围内八种黄酮类物质经过线性回归之后，得出的线性方程中R2均达到0.9990及以上，表明线性良好。并得出八种黄酮类物质的最低检出限值，表明所建立的色谱方法是可行的，仪器条件良好，测定所得结果可信。

2.4 精密度实验

通过对8种黄酮类物质的连续5次进样所得峰面积及保留时间，算出相对标准偏差发现其RSD值较小，表明该方法测定没食子酸、儿茶素、杨梅素、芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素精密度良好，进一步证明了方法的可行性。

2.5 稳定性实验和加标回收率实验

表4 稳定性和加标回收率实验结果（n=6）Table 4 Stability and sample recovery rate test results（n=6）

结果表明：在稳定性实验中RSD值较小，表明本实验测定方法的稳定性良好。同时，本法有较高的加标回收率，同时加标回收率的RSD值较小，故测定结果可靠。

2.6 黄酮类物质含量的测定

最终测定得到姜中杨梅素0.0469mg/g；芦丁0.0067mg/g；槲皮素0.019mg/g；木犀草素含量0.012mg/g。

3 讨论

黄酮的极性因种类不同存在很大的差异，这就为同时快速对样品中的多种黄酮的定性定量分析提供了很大的难度。

3.1 姜中黄酮的研究现状

由阅读大量文献可知测定除姜中的其他植物中果实、根、茎、叶中的黄酮含量文献比较多，但是从中文文献以及外文文献中已经发表的内容进行分析和整合，只看到有关姜中总黄酮的文献的报道，但并没有对姜中具体的单黄酮类物质分析的报道。并且有关其他植物中的关于黄酮类物质的分析最多是同时测定三种黄酮类物质的含量，并且色谱运行时间很长，造成了实验材料和时间上很大的浪费。本实验采用的是高效液相色谱法同时对8种常见的黄酮类物质进行分析，简便快速精确，弥补了在姜中成分的分析的一部分空缺，为以后姜中有效价值的利用率提供了新的思路。

3.2 酸抑制剂的选择

在实验中还遇到了一些问题，采用了如下的方法来解决。

由于黄酮类物质中含有酚羟基，因此为了抑制其解离以减少拖峰现象，在流动相中可以考虑加入酸类物质作为酸抑制剂，会使色谱峰尖锐，减少拖尾，分析时间缩短，常用的酸是磷酸和甲酸。本实验通过比较磷酸和甲酸在起到改善峰形，消除拖尾以及色谱峰重现性以及对色谱柱的维护等方面来考虑，来确定选择使用磷酸还是甲酸。

3.3 DAD检测器的优越性

DAD检测器与VWD检测器相比，其优势在于可以同时做多波段的扫描。根据黄酮类物质含量的测定的相关文献可知，没食子酸、儿茶素、杨梅素、芦丁、槲皮素、木犀草素、山奈酚、异鼠李素的最大吸收波长存在差异，因此选择单波长检测可能会存在局限，对样品以及标品含量的测定有不良的影响。

4 结论

本研究通过色谱条件的优化，确定出了最佳的色谱条件为色谱柱：HYPERSIR C18BDS（5μm×250mm× 4.6mm）；流动相：流动相A 甲醇、流动相B 0.1%甲酸水 ；流 速 ：0.8mL/min；检 测 波 长 ：270、370nm；柱 温30℃；进样量：10μL。利用此色谱条件可以同时对八种常见的黄酮类物质进行定量和定性分析。在使用此色谱方法来测定黄酮类物质，具有简便、灵敏、重现性好的优点，可有效的用于姜中木犀草素等黄酮类物质含量的测定。同时可以将此色谱分析方法广泛的运用于其他植物中黄酮类物质含量的定性分析以及定量测定。

通过对提取方法的评价，得出甲醇超声辅助法是提取姜中黄酮的最佳方法。经过精密度实验、稳定性实验、加样回收率实验来评价提取方法的可靠性，由数据分析可知用甲醇超声辅助法是可靠便捷的。

最终测定得到姜中杨梅素0.0469mg/g，芦丁0.0067mg/g，槲皮素0.019mg/g，木犀草素含量0.012mg/g。

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DAD-HPLC method for simultaneous determination of flavonoids in ginger

LI Tian-ye1，ZHAI Long-fei1，LI Yan1，GUO Lu1，WANG Xiang-hong1，2，*
（1.College of Food Science and Technology，Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，China；2.Hebei Agricultural Products Processing Engineering Technology Research Center，Baoding 071001，China）

Ginger is rich in nutritional value and medicinal health benefits，is also the important spice，had great development prospects.High performance liquid chromatography with diode array detector （HPLC-DAD） was employed to establish the detection method of flavonoids in ginger.Chromatographic conditions were as follows ：as the stationary phase HYPERSIR C18BDS ，mobile phase A methanol， mobile phase B 0.1%formic acid in water as the mobile phase，using gradient elution，flow rate 0.8mL/min at 30℃ ，detection wavelength of 270nm and 370nm.In the 0～125mg/L range eight flavonoids had good linear relationship within the linear range. The method was simple ， sensitive ， reproducibility and could be effectively used for the determination of the content of flavonoids concentrated ginger samples.

HPLC；ginger；gallic acid；rutin；quercetin

TS201.1

A

1002-0306（2014）22-0076-05

10.13386/j.issn1002-0306.2014.22.008

2014－02－25

李田叶（1990-），女，硕士研究生，研究方向：农产品加工与贮藏工程。

* 通讯作者：王向红（1973-），女，博士，教授，研究领域：食品科学。

河北省科技支撑计划项目（12277117D）。