半边旗有效成分5F对腹膜炎小鼠血清NO和细胞因子的影响

叶 华，龚先玲，李 立，吴科锋，吕应年，符伟玉，郑学宝

（广东天然药物研究与开发重点实验室，广东医学院，广东湛江524023）

·实验研究·

半边旗有效成分5F对腹膜炎小鼠血清NO和细胞因子的影响

叶 华，龚先玲，李 立，吴科锋，吕应年，符伟玉，郑学宝

（广东天然药物研究与开发重点实验室，广东医学院，广东湛江524023）

目的研究半边旗有效成分贝壳杉烷型二萜类化合物5F对腹膜炎小鼠血清一氧化氮（NO）和细胞因子IL－6、IL－10、TNF－α、MCP－1的影响。方法预先给予50和100 mg·kg－15F溶液3 d后，腹腔注射50 mg·kg－1酵母多糖建立腹膜炎模型，Griess法测一氧化氮含量，流式细胞术检测IL－6、IL－10、TNF－α和MCP－1的水平。结果与模型组比较，5F可以降低腹膜炎小鼠血清一氧化氮水平（P＜0.05），减少IL－6、IL－10、TNF－α和MCP－1含量（P＜0.05或P＜0.01）。结论5F可以有效减少酵母多糖诱导的腹膜炎小鼠血清一氧化氮、TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1含量。

半边旗；腹膜炎；一氧化氮；细胞因子

半边旗（Pteris semipinnata L.，PsL）是一种传统中药，广泛分布于我国南部，常被用于治疗各种炎症性疾病，如肝炎、病毒性肠炎和毒蛇咬伤等［1］。我们从半边旗中分离提取获得贝壳杉烷型二萜类化合物5F（ent－11α－hydroxy－15－oxo－kaur－16－en－19－olic acid），化学结构名为11－α－羟基－15－氧－16－烯－对映贝壳杉烷－19－酸［2］。前期研究发现，5F具有一定的抗炎作用，可以抑制脂多糖诱导的RAW264.7巨噬细胞活化。NO和细胞因子在炎症反应过程中具有重要作用。本实验通过建立酵母多糖诱导的急性腹膜炎小鼠模型，观察5F对小鼠血清NO、TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1的影响，评价5F的抗炎作用并初步探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 5F干粉由本实验室（广东天然药物研究与开发重点实验室）提供，经丙二醇溶解，蒸馏水稀释，制成丙二醇体积分数为0.15，5F质量浓度为1 000 mg·L－1的储备液，除菌过滤后冷藏保存，实验时再以培养基稀释至所需浓度（丙二醇最终浓度≤0.012）。雌性ICR小鼠，4～6周龄，体重18～22 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK（湘）2011－0003。酵母多糖购自Sigma公司，Cytometric Bead Array（CBA）Mouse Inflammation Kit购自BD－PharMingen公司，NO试剂盒购自碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1 腹膜炎小鼠模型的制备及分组给药 雌性ICR小鼠32只，随机均分为4组，空白组、模型组、5F低剂量组和高剂量组。5F低、高剂量组分别灌胃给予50和100 mg·kg－15F溶液，模型组灌胃给予等体积PBS，连续给药3 d。最后一次给药6 h后，除空白组外，其余各组小鼠腹腔注射50 mg·kg－1酵母多糖。6 h后断头采血，收集血清，4℃保存备用。

1.2.2 Griess法测NO含量 按照NO试剂盒说明书操作，于550 nm处测定吸光度值，根据所测亚硝酸盐浓度推算NO含量。

1.2.3 流式细胞术检测小鼠腹腔渗出液中IL－6、IL－10、TNF－α和MCP－1的含量 取50μL血清，与50μL包被特异抗体的捕获微球、50μL生物素标记的检测抗体混合物预混合，反应2 h。按照CBA试剂盒说明书操作，流式细胞仪进行样本和标准品检测，绘制标准曲线，计算样本含量。

2 结果

2.1 5 F抑制腹膜炎小鼠NO的释放 Griess法测腹膜炎小鼠血清NO含量，结果显示，5F组血清NO有所下降，其中100 mg·kg－1剂量组与模型组相比，差异具有显著性（见图1，P＜0.05）。

图1 5F对腹膜炎小鼠血清NO含量的影响

2.2 5 F对腹膜炎小鼠分泌细胞因子的影响 取各组动物血清，流式细胞术检测TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1水平，结果显示，与模型组相比，5F 50和100 mg·kg－1剂量组TNF－α、IL－6和MCP－1含量明显减少（P＜0.05或P＜0.01），5F 100 mg·kg－1剂量组IL－10含量明显减少（P＜0.01）（见表1）。

表1 5F对腹膜炎小鼠血清TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1含量的影响

3 讨论

酵母多糖诱导的小鼠腹膜炎是一个比较经典的动物急性炎症模型，发作快、攻击30 min后即可检出炎症反应，是一种炎症反应程度较轻的非致死性炎症［3～5］。本实验观察5F对酵母多糖诱导的腹膜炎小鼠血清NO和细胞因子的影响，结果显示，5F可以调节小鼠血清中异常的NO、TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1含量，与模型组相比，5F 50和100 mg·kg－1剂量组NO、TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1含量均有不同程度降低。

NO是炎症反应与免疫调节的效应因子，也是关键的调节因子，参与多种炎症信号传导，并与多种炎症因子相互作用［6］。研究发现，腹膜炎患者和动物模型的透出液和血清中NO升高，增高的NO进而调节腹膜血流，提高腹膜渗透性，影响腹膜转运功能［7，8］。本实验结果表明，模型组小鼠血清NO含量较正常对照组明显升高，与文献报道结果一致，而5F可以明显降低小鼠升高的血清NO含量，提示5F对腹膜炎小鼠的保护作用可能与降低 NO水平有关。

腹膜炎发生发展过程中单核巨噬细胞作为第一道防线，产生TNF－α和IL－1，进而刺激生成IL－6，激活并集聚白细胞［9，10］。这些前炎性细胞因子的释放实际是一种抵御炎症的宿主反应，然而释放过量会导致组织损伤。因此，机体还释放IL－4、IL－10等抗炎细胞因子，调节前炎性细胞因子的作用，平衡前者的损伤效应［11］。TNF－α和IL－6等促炎因子可显著增强MCP－1表达，并与相应受体结合启动炎性细胞的活化与迁移，并通过浓度梯度引导炎性细胞迁移到病灶发挥作用清除病原体［12］。在腹膜炎患者和动物模型都存在高水平的TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1，这些细胞因子继而刺激机体产生其他炎症介质，如活性氧、NO、自由基、花生四烯酸代谢产物等，并活化内皮细胞和中性粒细胞产生微循环损伤和组织损害［13～15］；药物治疗可以降低这些细胞因子的水平，减轻病情［16～18］。本实验结果显示，5F可以有效降低腹膜炎小鼠血清TNF－α、IL－6、IL－10和MCP－1水平而减轻脏器损伤，研究结果为进一步探讨5F的抗炎作用机制及新药开发提供了试验依据。

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Effect of 5F，an extract from Pteris sem ipinnata L.serum NO and cytokine levels in zymosan A－induced peritonitism ice

YE Hua，GONG Xian-ling，LILi，WU Ke-feng，LV Ying-nian，FUWei-yu，ZHENG Xue-bao
（Guangdong Key Laboratory for Research and Development of Natural Drugs，Guangdong Medical College，Zhanjiang 524023，China）

ObjectiveTo investigate the effect of 5F，an extract from Pteris semipinnata L.serum NO and cytokine levels in zymosan A－induced peritonitismice.M ethodsAfter pretreatmentwith 50 and 100 mg·kg－15F solution for 3 d，mice were intraperitoneal injection of 50 mg·kg－1zymosan to induce peritonitis.The release of nitric oxide wasmeasured by a Griess reagentsystem.The serum levels of IL－6，IL－10，TNF－αand MCP－1 were determined by flow cytometry.ResultsCompared withmodel group，5F pretreatment could decrease the overproduction of NO，IL－6，IL－10，TNF－αand MCP－1（P＜0.05 or P＜0.01）.Conclusion5F could significantly reduce the serum level of NO，TNF－α，IL－6，IL－10 and MCP－1 in zymosan A－induced peritonitismice.

Pteris semipinnata L.；Peritonitis；NO；Cytokine

R285.5

A

2095－5375（2014）12－0683－003

国家自然科学基金（No.30772701）；广东省科技计划项目（No.2009C3104003）；湛江市科技攻关项目（No.2012C3104019，2013A01008）；广东医学院重点项目（No.Z2013001）、面上项目（No.M2013003）和博士启动项目（No.B2013019）

叶华，女，讲师，研究方向：抗炎免疫药理学，E－mail：yehua2008＠foxmail.com