复方丹参片对类风湿性关节炎大鼠胫骨形态计量学静态参数的影响

肖彦燊，董文铭，王亚海

（湛江中心人民医院骨科，广东湛江524037）

复方丹参片对类风湿性关节炎大鼠胫骨形态计量学静态参数的影响

肖彦燊，董文铭，王亚海

（湛江中心人民医院骨科，广东湛江524037）

目的研究复方丹参片对大鼠类风湿相关骨质疏松的对抗作用。方法利用皮下注射牛Ⅱ型胶原诱导SD大鼠发病，建立胶原诱导性关节炎（collagen induced arthritis，CIA）大鼠模型，设立正常对照组、实验对照组和实验组（复方维生素D组及不同剂量的复方丹参组），分别给予灭菌用水、复方维生素D及不同剂量的复方丹参处理2月后，比较各组大鼠胫骨的干重、湿重、长度、周径以及骨组织形态计量学静态参数。结果实验各组及实验对照组中大鼠胫骨的湿重、干重及骨组织形态计量学静态参数显著低于正常对照组，而实验各组大鼠胫骨的上述参数显著高于实验对照组。结论复方丹参能部分抵抗类风湿疾病引起的骨质破坏和骨质疏松。

复方丹参；类风湿性关节炎；骨质疏松；胶原诱导性关节炎

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一种病因不明的自身免疫性疾病，在我国的患病率高达0.4%，有近400万患者［1］。骨质疏松症（osteoporosis）是以单位体积内骨量减少、骨的微结构退化、骨皮质变薄、骨小梁数目减少、骨髓腔增宽、骨强度减低和易于骨折为特征的系统性骨病。越来越多的研究发现RA患者极易发生骨质疏松，而骨质疏松极易造成腰椎压缩性骨折、股骨干骨折及手腕部桡骨骨折，成为RA的重要合并症，也是其产生严重并发症的重要促进因素［2］。不仅如此，RA相关的骨质疏松也是其影像学最早期的改变之一。积极发现并及时治疗类风湿性关节炎引起的骨质疏松具有重要的临床意义。本研究通过建立类风湿性关节炎大鼠模型，检测经复方丹参片处理后大鼠胫骨形态计量学静态参数的变化情况，探讨复方丹参片对类风湿相关骨质疏松的治疗效果，为类风湿相关骨质疏松的防治提供新方法。

1 资料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验动物 实验选用4月龄未交配的雄性SD大鼠，SPF级，平均体重（220±12）g，由中科院上海生命科学院实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCXK（粤）2009－0008。

1.1.2 实验药物 复方丹参片（0.32 g／片，广州白云山和记黄埔中药有限公司）；复方维生素D制剂（广东医学院科技医药开发中心提供）；牛Ⅱ型胶原蛋白（20 mg／瓶，Chondrex公司）；弗氏完全佐剂及不完全弗氏佐剂，钙黄绿素、盐酸四环素、Golder′s染料试剂（Sigma公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型的建立 参考高晓珺等［3］报道的方法，即：3%戊巴比妥钠溶液（1.5 mL·kg－1）腹腔注射将大鼠麻醉后，于每只大鼠尾根部皮下注射0.12 mL胶原乳剂（含胶原240μg）进行初次免疫。7 d后，同法于大鼠臀背部两侧皮下各注射0.03 mL胶原乳剂（共含胶原乳剂120μg）进行激发免疫。炎症评分≥2分即随机入组。

1.2.2 实验分组及处理 随机抽取10只大鼠归入正常对照组，将成功建立模型的大鼠60只随机分为实验组和对照组，每组12只。实验组以灌胃的方式给予复方丹参，每天1次，每次100μL，剂量依次为2.5、5、10 g·（kg·d）－1，阳性对照组给予复方维生素D制剂，正常对照组及实验对照组均给予同体积灭菌蒸馏水，三组的饲养环境及方式均相同（详见表1）。处理2月后，采用麻醉法处死大鼠，留取右侧胫骨组织用于分析。

表1 实验动物分组及给予药物剂量

1.2.3 骨标本的取材及制备 以3%戊巴比妥钠（1.5 mL·kg－1）进行腹腔注射麻醉，分离胫骨，去除肌肉，用低速锯切取胫骨上段组织，迅速将其置入10%磷酸盐缓冲液配制的甲醛溶液中固定24 h，再经70%乙醇脱水后，用特殊骨染料染色5 d。从50%乙醇开始逐级脱水及丙酮脱脂，最后用甲基丙烯酸甲酯包埋不脱钙骨，采用硬组织切片机切成9 μm厚片进行测量。

1.2.4 大鼠胫骨物理指标测定 大鼠麻醉处死后，取左侧胫骨，除净附着在骨上的肌肉和软组织，用AE240电子天平称量湿重（BWW）后于烤箱烘干至恒重，再次称量即为其干重（BDW）。用带表的游标卡尺测量胫骨内侧髁起至内踝之间的距离为胫骨长度（BL），胫骨中段的周径作为胫骨周长（BC）。

1.2.5 骨组织形态计量学测定 将右侧胫骨上端骨标本制成9μm骨切片后，在距离骨垢线1 mm处置远端3 mm沿生长板的走向分别画波浪线或直线，然后测量该范围内的骨组织总面积，骨小梁总面积及骨小梁总周长，计算骨小梁面积百分数（%Tb.Ar），骨小梁宽度（Tb.Wi），骨小梁数量（Tb.N），骨小梁分离度（Tb.Sp）。

1.2.6 统计学分析 采用SPSS 16.0统计软件包对实验数据进行统计学分析，所有数据以±s表示，采用单因素方差分析及LSD－t检验进行组间两两比较，P＜0.05时有统计学意义。

2 结果

2.1 复方丹参片对大鼠胫骨物理指标的影响 与正常对照组相比，实验对照组中大鼠胫骨湿重（BWW）和干重（BDW）明显降低（P＜0.05），而胫骨长度（BL）及胫骨中段周长（BC）无明显变化（P＞0.05），表明类风湿疾病导致了明显的骨质破坏和骨量减少，而对骨的长度和周径无显著影响。在低、中及高剂量复方丹参组和复方维生素D组，大鼠胫骨的BWW和BDW均显著高于实验对照组（P＜0.05），但BL及BC无明显变化（P＞0.05），表明复方丹参同复方维生素D一样，能改善类风湿疾病引起骨质破坏和骨质疏松，但对骨的长度及骨的周径并无显著影响（表2所示）。需要注意的是，高剂量复方丹参片及维生素D组中大鼠胫骨的BWW和BDW仍然显著低于正常对照组（P＜0.05），表明二者均未能完全改善类风湿疾病导致的骨质破坏。

表2 复方丹参片对大鼠胫骨物理指标的影响（±s）

表2 复方丹参片对大鼠胫骨物理指标的影响（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与实验对照组比较，＃P＜0.05

组别 BWW（mg）BDW（mg） BL（mm） BC（mm）831.2±26 672.2±18 32.3±0.4 4.4±0.3实验对照组 669.3±31*516.8±20*34.8±0.7 4.6±0.2复方丹参低剂量组 706.2±19＃567.3±14＃31.7±0.9 4.2±0.5复方丹参中剂量组 751.5±23＃613.3±18＃29.9±0.7 4.3±0.7复方丹参高剂量组 811.6±22＃*653.8±16＃*30.5±0.8 4.7±0.4复方维生素D组 803.2±28＃*642.6±20＃*正常对照组33.6±0.5 4.5±0.6

2.2 复方丹参片对大鼠胫骨上段松质骨骨组织形态计量学参数的影响 正常对照组、实验对照组及实验组大鼠胫骨上段骨组织计量学中静态参数骨小梁面积百分数（%Tb.Ar）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁分离度（Tb.Sp）的变化情况如表3所示。同正常对照组相比，实验对照组的%Tb.Ar、Tb.Th及Tb.N显著降低（P＜0.05），而Tb.Sp显著增加（P＜0.05），提示类风湿病变导致大鼠胫骨上段松质骨结构发生了明显变化，呈现出典型的骨质疏松状态。而低、中、高剂量复方丹参组及复方维生素D组中，%Tb.Ar、Tb.Th及Tb.N的值较实验对照组显著增加（P＜0.05），Tb.Sp值则显著降低（P＜0.05），提示复方丹参片及复方维生素D明显改善了类风湿病变导致的骨质疏松状态。另外，高剂量复方丹参组及复合维生素D组的上述参数同正常对照组相比仍然存在显著差异（P＜0.05），表明二者均未能完全改善类风湿疾患引起的骨质疏松。

表3 复方丹参片对大鼠胫骨上段松质骨形态计量学静态参数的影响（±s）

表3 复方丹参片对大鼠胫骨上段松质骨形态计量学静态参数的影响（±s）

注：与正常对照组比较，*P＜0.05；与实验对照组比较，＃P＜0.05

组别 %Tb.Ar Tb.Th（μm）Tb.N（＃／mm）Tb.Sp（μm）28.1±3.3 58.3±9.3 5.1±0.7 208.1±32.2实验对照组 8.3±1.6*37.6±2.3*1.2±0.27*469.2±57.5*复方丹参低剂量组 13.6±1.1＃41.3±1.8＃1.7±0.28＃375.3±36.4＃复方丹参中剂量组 16.7±2.2＃45.1±2.9＃2.7±0.35＃346.4±38.4＃复方丹参高剂量组 21.3±2.9＃*47.1±2.7＃*3.2±0.45＃*272.3±30.6＃*复方维生素D组 20.7±2.5＃*50.6±3.5＃*3.4±0.43＃*264.7±29.6＃正常对照组*

3 讨论

类风湿性关节炎是以关节组织慢性炎症性病变为主要表现的全身性自身免疫性疾病，其发病率在自身免疫性结缔组织病中列居首位。研究发现，全身性骨质疏松和近关节的骨破坏是其最常见的并发症之一，在其发病的2年内即可能出现［4］。如不加以干预，这种骨质疏松和骨质破坏会贯穿于整个RA病程之中，造成人群劳动力丧失和致残［5］。由于原因不清，目前临床上尚缺乏有效的治疗手段和早期干预措施。因此，寻找类风湿相关骨质疏松的有效治疗方法具有非常重要的意义。

作为著名的传统中药，丹参具有抗氧化、改善微循环，防止血栓形成等多种作用［6］，有关丹参的各种制剂已经被广泛应用于临床心血管疾病的治疗［7］。但相比之下，有关丹参的骨药理作用研究的不多，其在这方面的研究目前也仅限于其对骨折［8］、绝经后骨质疏松［9］、糖皮质激素导致的骨质疏松［10］等方面。为进一步增加丹参的应用范围，更为了给类风湿相关骨质疏松的治疗寻找有效的治疗方法，本研究是首次通过类风湿相关骨质疏松大鼠模型，就复方丹参对类风湿相关骨质疏松的治疗效果进行的探讨，并对其能够有效减轻类风湿相关骨质疏松的机制进行的初步分析。

本研究发现，实验对照组中大鼠胫骨的湿重、干重均显著低于正常对照组，表明类风湿疾病能显著引起骨质破坏及骨质疏松，这与类风湿疾病的流行病学调查结果是一致的。然而，复方丹参各实验组及复方维生素D组中大鼠胫骨的干重、湿重介于正常对照组和实验对照组之间，且与两组存在统计学意义的差异，表明复方丹参仅仅能够在一定程度上减轻类风湿病变引起的骨质疏松和骨质破坏。丹参的骨药理学作用研究发现，复方丹参可以通过增加骨组织局部的血液供应，影响各种修复细胞如成骨细胞、破骨细胞、成纤维细胞等的功能，促进骨痂形成进而促进骨折愈合［11］。本研究中胫骨上段松质骨形态计量学静态参数表明，复方丹参组中大鼠胫骨的各参数值均显著高于实验对照组，表明该组中骨组织的骨量明显增加，骨质疏松程度明显缓解，说明丹参能够有效增加骨量形成，减轻骨质疏松。因此，其机制可能与促进骨折愈合的机制有关。

此外，需要注意的是，同正常对照组相比，即使高剂量丹参治疗组及复方维生素D组中的各参数都是显著偏低的，表明丹参及复方维生素D并未完全缓解类风湿因素造成的骨质破坏。目前，类风湿引起骨质疏松的原因被认为主要有两个方面［12］：一是类风湿本身激发自身免疫反应导致的直接或间接地骨质损坏，主要表现为破骨细胞的激活和由此导致的骨质破坏。二是在类风湿治疗过程中使用大剂量糖皮质激素所引起的骨质疏松，主要表现为大量糖皮质激素引起成骨细胞数量减少、活性降低和生存时间缩短。本研究在动物模型的建立及后续处理中并未使用糖皮质激素，表明复方丹参片未能完全缓解类风湿疾病造成的骨质疏松的原因可能与糖皮质激素造成骨质疏松的机制无关，而可能是通过目前尚不清楚的机制改善了类风湿疾病引起的骨质疏松。因此，为进一步明确丹参的骨药理作用，有必要进行更加深入的研究以探讨丹参改善类风湿相关疾病导致的骨质疏松可能机制。

综上，复方丹参片能够显著缓解类风湿疾病相关骨质疏松，但是这种缓解是不完全的，其机制需要进一步深入研究。

［1］陈娟，林庆衍，陈梅卿，等.风湿性疾病与骨质疏松症［J］.中国骨质疏松杂志，2012，18（1）：83－86.

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［6］冯敏.丹参酮ⅡA对心血管影响的研究进展［J］.大家健康（下旬版），2013，（12）：145.

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［11］王俊国，曹斌.丹参促进骨折愈合的研究进展［J］.中国骨伤，2003，16（10）：637－638.

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Effect of Fufang Danshen Tablets on static bone histomorphology parameters of cancellous bone tissue in CIA rats

XIAO Yan-shen，DONGWen-ming，WANG Ya-hai
（Central People′s Hospital of Zhanjiang，Zhanjiang 524037，China）

ObjectiveTo study the effect of Fufang Danshen Tablets against osteoporosis of CIA rats.MethodsCIA ratmodel was established by injecting bovine type II collagen subcutaneously.Three groups including normal control group（n＝10），experimental control group（n＝12）and experimental group（n＝12）were built and themice were treated with sterilized water or Fufang Danshen Tablets，respectively for 2 months.Parameters including wet weight，dry weight，length and circumference，aswellas the static bone histomorphology parameters of themice shin bone in each group were collected for analysis.ResultsThe wetweight，dry weight and static bone histomorphology parameters of bone tissue in experimental and experimental control group were significantly lower than that in normal control group，the similar resultswere found between experimental control group and experimental group.ConclusionFufang Danshen Tablets can obviously inhibit bone erosion and osteoporosis in CIA rats，but further study was needed for clarifying themechanism.

Fufang Danshen；Rheumatoid arthritis；Osteoporosis；CIA

R965

：A

2095－5375（2014）07－0379－004

肖彦燊，男，主治医师，研究方向：骨质疏松的预防与治疗，E－mail：xysh1979＠126.com