基因工程在治疗周围神经损伤中的应用

王一雄(综述)，武忠炎(审校)

(新疆医科大学第五附属医院骨科，乌鲁木齐 830011)

周围神经损伤常导致局部感觉与运动功能障碍，而受损神经连续性的恢复是神经再生和功能恢复的决定因素。目前常用的显微手术修复和神经移植等方法虽可恢复受损神经的连续性，但均存在着诸多弊端，神经再生及功能的恢复仍无法令人满意[1]。神经损伤后，修复目的是为了恢复神经的连续性，为神经再生创造条件；而再生的成功与否取决于是否具有适合其生长的再生微环境。神经营养因子等物质成分是再生微环境中的重要因素，对再生神经的生长和延伸起着十分重要的营养和诱导作用。基因工程技术可将神经营养因子基因转染到合适的靶细胞，再移植到受损神经局部，为受损神经提供适合再生的微环境所需的神经营养因子，促进神经再生。因此，周围神经损伤的基因治疗有着极大的应用潜力。

1 周围神经损伤再生

神经损伤后，损伤神经远端发生瓦勒变性，轴突及其髓鞘裂解并被巨噬细胞吞噬，随后施万细胞增殖形成Bungner带并分泌多种神经营养因子，加上远端神经变性后保留的基底膜管，构成了受损神经再生微环境，最终实现神经再生。大量研究报道表明，神经营养因子在神经损伤后神经细胞的存活、轴突发芽和延伸的过程中起着十分重要的营养和诱导作用[2-3]。此外，还有促神经轴索生长因子和细胞外基质等物质在微环境中对神经再生起作用。由此可见，周围神经再生有赖于神经营养因子的营养支持及细胞外基质和基底膜管构成的微环境。

2 周围神经损伤的基因治疗

基因治疗是将有特定功能的基因导入靶细胞并植入受损神经局部，使其表达并发挥生物学效应，达到治疗目的。基因治疗的关键是目的基因的选择、载体工具的选择及靶细胞的选择。

2.1神经营养因子和目的基因的选择 神经营养因子是由靶组织合成的一组可经轴浆逆行转运至神经元胞体,并对其提供营养支持以及维持其存活的多肽类物质。其作用机制为：通过与靶细胞表面特定种类的酪氨酸激酶受体结合，激活受体并通过细胞内信号转导产生蛋白磷酸化作用，最后激活基因。神经损伤后轴突的连续性中断，神经营养因子无法逆行转运至神经元胞体发挥作用，此时外源加入神经营养因子可诱导再生的轴突沿神经营养因子的浓度梯度生长并维持神经元存活。神经营养因子主要包括神经生长因子、脑源性神经营养因子、碱性成纤维细胞生长因子、睫状神经节营养因子、神经营养素3、4/5、6、7等。此外，还有其他的神经营养因子，如白细胞抑制因子、类胰岛素生长因子、表皮生长因子、胶质源性神经营养因子、血小板源性生长因子、转化生长因子β等。黄昭瑄等[4]用神经生长因子治疗糖尿病周围神经病变，发现神经生长因子是治疗糖尿病周围神经病变的一种安全、有效的药物。郑明辉等[5]通过实验证实，脑源性神经营养因子基因修饰骨髓间充质干细胞对周围神经损伤后神经纤维的再通及功能恢复有促进作用。王晓亮等[6]通过动物实验证实,应用碱性成纤维细胞生长因子-壳聚糖导管能有效修复周围神经损伤并使大鼠运动功能得到改善。周洪伟等[7]通过动物实验发现，睫状神经节营养因子能显著促进大鼠视神经节细胞突起再生，且高浓度的睫状神经节营养因子能较早促进突起再生。

近年来许多神经营养因子基因得到克隆，通过基因转染技术，将神经营养因子基因转染到合适的受体细胞，再移植到损伤局部，使其向损伤局部提供神经营养因子，为损伤神经提供适合再生的微环境，促进损伤神经再生。Sorensen等[8]经实验证实,可通过腺病毒将神经营养因子的基因转移至受损神经的施万细胞，使其有效表达来促进损伤神经的修复。Gravel等[9]将携带脑源性神经营养因子和睫状神经节营养因子基因的重组腺病毒载体直接转入大鼠损伤神经的施万细胞，使其有效表达，促进了神经轴突的再生。此外，还有许多研究和报道表明，Ad-32Ep65-Flag基因、Bex-1(brain-expressed X-linked) 基因、Wld(S) (Wallerian degeneration slow) 变异基因、miR-1和miR-206基因、PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10)基因等均可在周围神经损伤的修复治疗中发挥作用，促进损伤神经的再生[10-15]。

2.2基因治疗途径与载体工具 基因治疗有两种基本途径：①体内直接基因治疗或称一步法(invivo)：指将含外源基因的重组病毒、脂质体或裸露的DNA直接导入体内。一步法的优点是无需中介细胞的参与、操作简便、实用性强、更接近于临床；弊端是该法尚不成熟，存在疗效短、免疫排斥及安全性等问题。但一步法是基因转载治疗的研究方向，该法成熟与否决定了基因治疗能否真正走上临床；②体内间接基因治疗或称二步法(exvivo)：指将外源基因克隆至一个合适的载体，首先导入体外培养的有特定条件的细胞，经筛选后将能表达外源基因的受体细胞重新输回受试者体内。该法较经典、安全，而且易控制效果，但步骤繁琐、技术难度大、不易推广。

基因载体需含有可供目的基因表达的特定调控序列，包括病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转移效率高，但存在一些问题，如病毒产物的免疫原性、基因转移靶向性以及基因表达的时间和水平等。目前常用的病毒载体有腺病毒载体、单纯疱疹病毒相关载体、腺相关病毒载体、反转录病毒载体。Hayashi等[16]研究了由腺病毒携带的人肝细胞生长因子对成年大鼠周围神经撕脱损伤的作用，发现腺病毒可作为周围神经损伤基因治疗的有效载体。Dhar等[17]通过研究证实了单纯疱疹病毒作为基因载体在组织工程学有广阔的前景。反转录病毒由于其较高的致突变性以及不能感染非分裂细胞,因此将它用于治疗神经元损伤可能性较小。但通过导入自杀基因或编码毒性因子的基因来治疗脑肿瘤等神经系统疾病有较大的潜力，所以反转录病毒作为载体治疗神经损伤有一定的前景，尚需深入研究。腺相关病毒是一种缺陷病毒，它可以靶向整合，能感染分裂和静止细胞，现被认为是神经系统基因治疗中最有前途的高效载体。但因其装载外源基因的容量有限，目前主要应用于中枢神经损伤的治疗。非病毒转运载体转导的外源基因不整合入宿主细胞的基因，不改变宿主细胞的基因组，但外源基因有效表达时间较短。目前主要应用裸DNA注射法、电穿孔法、磷酸钙沉淀、显微注射法、脂质体法等。

2.3靶细胞的选择 基因工程所需的靶细胞是指能摄取外源基因并保持其稳定表达的细胞，要求有良好的分裂增殖能力、良好的促外源基因表达能力和良好的生物安全性。主要有施万细胞、骨髓间充质干细胞、神经干细胞和胚胎干细胞等。目前研究最多的是施万细胞和骨髓间充质干细胞。

2.3.1施万细胞 施万细胞在周围神经损伤、再生与修复中起着关键作用，其作用主要有：①增殖形成Bungner带，为再生轴突生长提供通道[18]；②分泌多种神经营养因子，维持神经元存活，促进再生轴突生长；③分泌与神经再生有关的细胞外基质成分以及可引导轴突再生的黏附因子，为再生轴突提供良好的再生微环境，促进神经再生；④包绕再生轴突，形成无髓及有髓纤维、促进再生轴突的成熟；⑤与再生轴突形成缝隙连接和紧密连接，直接与再生轴突进行物质交换。Hadlock等[19]用填充施万细胞的聚合物植入神经缺损处，发现可以显著促进神经纤维的再生。但有研究发现，施万细胞缺乏持续分泌再生轴突稳定生长所需的神经营养因子和细胞外基质等物质的能力[20-21]。增强施万细胞分泌效应的持续性成为影响神经再生的关键。于志勇等[22]通过实验发现，导入神经生长因子基因的施万细胞可在体内长期存活并形成新的髓鞘，促进轴突生长和损伤神经的再生，为慢性神经损伤的基因治疗提供了新的方法。施新革等[23]提出转染神经生长因子3基因的施万细胞移植于损伤的周围神经，有促进神经生长、髓鞘再生的作用，能弥补单纯细胞移植、神经营养因子含量的不足。因此，施万细胞可作为良好的基因受体靶细胞应用于基因治疗周围神经损伤。

2.3.2骨髓间充质干细胞 骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中除造血干细胞外的另一种干细胞，来源丰富、有多向分化潜能、自我复制能力强、易于在体外获得和扩增、免疫原性低，且其独特的细胞增殖模式使外源基因易于导入并表达。大量研究表明，骨髓间充质干细胞可以在体外及体内诱导分化为神经组织的细胞，并能分泌多种利于神经再生的神经营养因子，促进轴突的再生和髓鞘形成[24-25]。Nie等[26]将骨髓间充质干细胞与胶原混合后放入聚乳酸聚羟基乙酸共聚体管中，桥接大鼠坐骨神经缺损，发现骨髓间充质干细胞可促进神经再生。黄世勇等[27]通过实验证实，导入神经生长因子基因的大鼠骨髓间充质干细胞可在大鼠体内存活并稳定表达。所以，骨髓间充质干细胞可较好地作为基因工程的靶细胞应用于周围神经损伤的治疗。

3 结 语

基因工程技术在周围神经损伤治疗的领域有广阔的应用前景，但许多研究尚处于基础研究和动物实验阶段，存在许多的不足，没有广泛应用于临床治疗的条件，还存在一些问题亟待解决，如目的基因的高效持续表达的问题、基因转染途径的实用性问题、载体工具的安全性问题、靶细胞选择的理想性问题以及基因转移中的不良反应问题等。相信随着相关研究的不断深入，基因工程技术会最终成为周围神经损伤的临床治疗的重要手段。

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