欧美杨溃疡病菌在侵染寄主过程中的动态变化1)

商 靖 李 永

(省部共建森林培育与保护教育部重点实验室(北京林业大学)，北京，100083) (中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所)

李爱宁 贺 伟 郭利民 常聚普

(省部共建森林培育与保护教育部重点实验室(北京林业大学)) (河南省濮阳市林业科学院)

责任编辑:程 红。

欧美杨(Populus ×euramericana)属杨柳科(Salicaeeae)、杨属(Populus)，在意大利、法国、瑞典、美国、加拿大、南斯拉夫、韩国等国家大量种植。该树种生长迅速、用途广泛，是木材工业和造纸工业的理想原料。近年来，欧美杨在中国的河南、山东等地也进行了大面积栽培。然而，自从2005年，河南濮阳、山东菏泽等地发生了欧美杨溃疡病，经鉴定其病原菌为Lonsdalea quercina subsp.populi［1］，该病害为我国新的林木病害。目前该病菌仅在我国和匈牙利有报道［2］。中林46 杨(P.×euramericana‘zhonglin 46’)等欧美杨品种染病后产生大量伤流，损耗树木养分，使树木材积和其他可利用部分减少;同时，由于韧皮部局部坏死，造成病部枝干和顶梢枯死，严重影响树木的健康生长，甚至造成死亡。因此，在病害尚未大面积流行前，通过快速、准确的早期检测、及时制定药剂防治措施对降低初始菌源量、抑制或减慢病害的发展具有极其重要的意义。近年来，分子生物学技术的发展使得对病害的快速检测成为可能，尤其是Realtime PCR 技术可以定量检测植物病原菌，具有快速简便、灵敏度高、特异性强和高通量等优点，而且不受寄主症状的影响，近几年在植物病原菌的分子检测和定量分析中也得到了充分的应用［3-5］。例如，Gachon等［6］、Böhm 等［7］、Mercado - Blanco 等［8］、潘娟娟等［9］、孙蕾等［10］都利用该方法实现了对病原菌在寄主植物内动态变化的追踪。目前，国内外尚未见关于欧美杨溃疡病早期定量监测方法的报道。本研究应用Real-time PCR 方法，定量测定欧美杨溃疡病病原菌在侵染过程中的动态数量变化，同时对病原菌侵染后在植物组织中的扩展情况进行组织病理学研究，旨在明确病菌的侵染方式，为欧美杨溃疡病的早期诊断和防治决策提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌接种

欧美杨溃疡病病原菌菌株Lonsdalea quercina N-5 -1 保存于北京林业大学森林保护实验室。中林46 杨2年生枝条由河南省濮阳市林业科学院提供。选择健康的欧美杨枝条，用灭菌水洗净，然后再用75%的酒精擦拭接种点b(图1)，用灭菌小刀在接种点划5 mm×5 mm 的十字形小口，注入107菌落·mL-1的菌悬液100 μL，用蘸有无菌水的脱脂棉块覆盖在接种点上保湿。对照接种无菌水。将接种后的枝条置于小桶中，用无菌水水培，置于光照培养箱(温度30 ℃，相对湿度90%，每日光照14 h)中培养。

1.2 欧美杨接种枝条总DNA 的提取

将组织剪碎，在液氮冷冻下研磨成粉末状。每100 mg 样品中加入1 mL CTAB，100 μL 10% SDS，60℃温育40～50 min。13 000 r·min-1离心10 min，取上清800 μL 于另一离心管中。加入等体积氯仿，13 000 r·min-1离心10 min，取上清400 μL 于另一离心管中。加入等体积异戊醇，4 ℃静置20 min，13 000 r·min-1离心10 min，弃上清，加入800 μL 75%酒精，13 000 r·min-1离心3 min，弃液体，13 000 r·min-1离心3 min，弃液体。晾干至无酒精味，加入20～40 μL TE 溶液，-20 ℃保存。

1.3 欧美杨组织中病原菌DNA 的Real-time PCR定量分析

应用特异性引物LqfF/LqfR(另文发表)扩增L.quercina DNA，使用ABI 7500 system (Applied Biosystem，Carlsbad，CA，USA)进行Real-time PCR 扩增。

从LB 液体培养的细菌中提取基因组DNA，用紫外分光光度计(Perkin Elmer，USA)测定DNA 质量浓度后，10 倍梯度稀释，进行定量PCR，制作标准曲线。根据标准曲线测定样品中的DNA 质量浓度。

使用SYBR®Premix Ex TaqTMII 试剂盒(Taraka，大连)，20 μL 实时定量PCR 体系为，10 μL SYBR®Premix Ex TaqTMII，10 μmol 引物LqfF/LqfR各0.6 μL，0.4 μL ROX Reference Dye II (50 ×)，2.0 μL 模板DNA，6.4 μL ddH2O。实时定量PCR 反应条件为，95 ℃预热30 s，(95 ℃5 s，60 ℃34 s)，40个循环。在每个循环的退火步骤时，进行荧光信号的采集。PCR 循环结束后，升温至95 ℃，降温至60℃，再以0.5 ℃/s 缓慢升温至95 ℃，生成融解曲线。

1.4 接种后欧美杨组织中病原菌含量及扩展规律的Real-time PCR 定量检测

按照1.1 的方法接种欧美杨枝条(带叶，长30 cm)，分别在接种后3、5、7、9、11、13、15、17 d 各采集4 个接种枝条及1 个对照。每个枝条采集a、b、c 3 个点(其中b 点为接种点，a、c 点未接种为取样点，包含韧皮部和木质部)及枝条上的叶部组织Y 点(图1)样品各100 mg，重复3 次，进行总DNA 提取。使用时稀释10 倍，用引物LqfF/LqfR 进行Real -time PCR 扩增。应用标准曲线获得的方程式，计算欧美杨溃疡病病原菌的带菌量(反应体系和条件同1.3)，并获得接种植物组织内溃疡病病原菌DNA 随时间变化的定量关系。

图1 欧美杨植株采样示意图

1.5 病理学观察

采样方法同1.4，将采得的植物组织材料置于FAA 固定液中固定，木质部置于V(酒精)∶ V(甘油)=1∶ 1 的溶液中固定，一周后用石蜡切片法和木材切片法制成永久切片，切片厚度为8～9 μm，再将切片粘到载玻片上进行展片、染色，切片在光学显微镜下观察显微结构，并拍照，调查不同采样时间病原菌的存在状态、分布情况。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的制作

将欧美杨溃疡病病原菌14 ng DNA 进行5 次10倍梯度稀释，用引物LqfF/LqfR 进行Real - time PCR 分析，制作标准曲线。结果表明，DNA 质量浓度(y)与Ct值(x)之间呈高度的相关性(y = -3.300 0x +20.037 7，R2=0.990 0)(图2a)。

图2 实时定量PCR 标准曲线

为了确定欧美杨(中林46)DNA 是否影响L.quercina DNA 的定量分析，将14 ng L.quercina 基因组DNA 进行5 次10 倍梯度稀释，分别加入到含有14 ng 中林46 杨基因组DNA 的样品中，使得病原菌DNA 和植物DNA 质量浓度的比值从1∶ 1 变化到1∶ 100 000，用引物LqfF/LqfR 对DNA 混合样品进行荧光定量PCR。结果表明:L.quercina DNA 质量浓度(y)与Ct值(x)之间呈高度的相关性(y =-3.310x+21.081，R2=0.990)(图2b)。因此，即使在高浓度的中林46 杨DNA 存在的情况下，引物LqfF/LqfR 仍具有较好的特异性和灵敏度，可用于L.quercina 侵染过程的定量PCR 分析。

2.2 病原菌存在状态及动态分布

应用Real-time PCR 测定表明(表1)，采样点a、c 和枝条上的树叶中都没有菌量的积累，接种点b处，病原菌在接种侵染3 d 后植株内己有一定的菌量积累，但植株并未显症;接种5 d 后，病原菌数量明显增加，植株开始显症;从第7 天开始，有黏液流出，病情逐渐加重;9～15 d，病原菌量逐渐达到峰值，13 d 后，进入稳定期;接种15 d 后，病原菌DNA质量达到7.2 ng。

表1 欧美杨枝条接种L.quercina 后不同时间的种群数量

图3 欧美杨与溃疡病菌互作的组织病理学

2.3 感病欧美杨的组织病理学

从图3a-e 可以看出，健康的欧美杨韧皮部组织切片细胞结构完整，形态规则，细胞排列整齐，细胞壁薄，细胞内部透明，细胞核清晰可见。木质部组织的导管壁薄，导管形状多为圆形或者卵圆形，薄壁细胞和射线细胞内部透明，排列有序，细胞形状规则。采样点a 和c 处的组织切片与健康组织切片无区别，而接种点b 处的组织切片结果与健康组织相比发生了明显的变化。

接种侵染3 d 后的欧美杨组织(图3f)细胞壁增厚，染色后颜色比健康组织深，从植物组织结构上看，该病原对植物尚未造成明显的伤害。从接种后第5 天开始，在横切面上(图3g)可以清晰地观察到韧皮部细胞内有较多染色加深物质(图3h)，薄壁细胞中次之(图3i)，并且在其中的细胞间隙也存在此类物质。在纵切面(图4a)上，可观察到不规则细胞，有少数细胞发生破裂。感病欧美杨靠近韧皮部的发病木质部组织中导管壁、射线细胞壁增厚，部分导管内有侵填体(图4b)。接种9～17 d，在树皮横切面可以看到，韧皮部部分细胞解体，形成较大空腔，薄壁细胞次之(图4c)。薄壁组织细胞中也出现了较多的染色加深物质(图4d)，从径向切面可以看出，细胞形状不规则，细胞融合(图4e)。从感病欧美杨木质部组织三切面可以看出(图4f -h)，导管和射线细胞内侵填体数量增多，朝向心材方向组织健康(图4i)，其它无明显变化。

图4 L.quercina 侵染后欧美杨组织病理学

3 结束语

尽管已经有大量研究［11-15］将Real -time PCR应用于其他植物病原菌侵染过程的检验，但将其应用于欧美杨溃疡病发生初期的检测尚属首次，这为欧美杨溃疡病的早期诊断提供了新的途径与方法。

欧美杨溃疡病病菌的侵染方式为局部侵染。病原菌侵染植物后，树皮和木质部组织都产生一系列的生理反应来阻止病原菌的进一步扩展，如细胞壁增厚、产生侵填体等。同时，在接种后产生的病斑中，韧皮部细胞变色多于薄壁组织，说明病原菌主要集中在韧皮部，病斑以外的组织与健康组织相比没有区别。在距离接种点10 cm 之外的皮层和叶片组织中未检测到病原菌，说明病菌侵入后未进入离接种点较远的皮层组织和叶片中;从木质部横断面看，靠近韧皮部的浅层木质部中有侵填体，而朝向心材的木质部中无侵填体，表明病菌在侵染过程中，其扩展仅仅局限在侵染点周围较小的范围内。本试验只是在室内接种枝条上进行了研究，田间自然情况下病菌侵染方式是否与室内接种枝条研究结果一致还有待进一步研究。

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