高效液相色谱法检测鸡肉中替米考星药物残留的检测与分析

曹忠君

（辽宁省铁岭市畜产品安全检测站，辽宁 铁岭 112000）

高效液相色谱法检测鸡肉中替米考星药物残留的检测与分析

曹忠君

（辽宁省铁岭市畜产品安全检测站，辽宁 铁岭 112000）

本研究应用高效液相色谱法对来自市场中64批次鸡肉样品进行替米考星药物残留的检测。结果表明，替米考星药物残留物在鸡肉中的平均回收率为70.5%～92.3%。显示该方法具有灵敏、快速的特点，符合现行兽药残留分析的要求。替米考星药物残留有一定检出率，相关部门应加强监管。

替米考星；鸡肉；高效液相色谱法

替米考星（ti lmicosin，TIL）属于大环内酯类抗生素（macrol ide antibiotics，MALs），其分子式为C46H80N2O13，分子量为869.15。英国Elanco动物保健品公司在20世纪80年代开发成功。在巴西、马来西亚、澳大利亚、法国、美国、西班牙等国家被批准用于兽医临床。现已通过了我国农业部兽药评审委员会的严格审核，获得国家三类新兽药证书和批准文号[1]。替米考星为中谱抗生素，其特征是抗革兰氏阳性菌活性、抗支原体活性和低毒性，在鸡养殖生产中，用于预防和治疗支原体病等。其危害是损害前庭和耳蜗神经，导致眩晕和听力减退。药物在体内蓄积达到一定的浓度，可造成肝肾的严重损害[2]。Kohanski等[3]通过试验证明，亚剂量的抗生素会导致细菌发生基因突变，从而发生单重或者多重耐药性。鸡肉中若存在亚剂量的抗生素，可利用选择压力方式，导致细菌发生突变，从而使其获得抵御抗生素的能力。如果食用者食用含有耐药菌株的鸡肉后，有可能会发生耐药菌株在体内蓄积，倘若耐药菌株把耐药基因利用基因交换传播给体内的致病细菌，结果会使人体诱发严重疾病。我国农业部于2002年12月24日发布了第235号公告，对动物性食品中兽药最高残留限量予以规定。其中，规定替米考星在鸡肉中的最高残留限量不得超过75μg/kg。

目前常用的测定动物性食品中替米考星及其活性代谢物残留量的方法主要有酶联免疫法、胶体金免疫层析法、高效液相色谱法和紫外分光光度计法等。高效液相色谱法具有高效、灵敏、准确等特点，是目前应用最普遍的一种方法。

本研究旨在验证高效液相色谱法检测鸡肉中替米考星药物残留的可行性，也为了了解、调查某城市市场中流通鸡肉替米考星药物残留的实际情况，为相关部门预防和治理食品安全问题提供依据和参考。

1 材料与方法

1.1 仪器和设备美国WATERS公司2695型高效液相色谱仪，配有2998二极管阵列检测器；飞利浦公司HR2168型绞肉机；HITACHI公司CF160RXⅡ立式高速冷冻离心机；北京天平物华医疗仪器有限责任公司DT-200电子天平（感量0.01 g）；赛多利斯科学仪器（北京）有限公司CP225D型电子分析天平（感量：0.000 01 g）；德国IKA（广州）仪科实验室技术有限公司MS3(基本型)蜗旋混合器；昆山市超声仪器有限公司KQ-250DB型数控超声波清洗器；天津市恒奥科技发展有限公司Type HSC-24A型24孔水浴加热氮吹仪，连接纯度99.9%以上氮气；江苏省金檀国华仪器厂HY-4型振荡器；美国奥康公司24孔固相萃取装置；Agela Technologies公司Cleaner t C18-SPE（500 mg/6 mL）固相萃取柱；Discovery C18（25 cm×4.6 mm，5μm）色谱柱；Thermo公司移液器（50μL、300μL、1 mL、10 mL 4种规格）。

1.2 试剂和材料替米考星（ti lmicosin，TIL）标准品（中国兽医药品监察所），色谱纯乙腈（Fisher公司），色谱纯甲醇（Fisher公司），水为二次蒸馏水，磷酸二氢钾，乙酸，乙酸铵，50 mL、100 mL规格聚乙烯离心管，0.5μm有机相微孔滤膜。

64批次鸡肉样品，分别于2013年下半年至2014年上半年不同时期在多个市场随机抽取。样品编号为：CM/CL001～CM/CL064。

1.3 方法

1.3.1 标准品和溶液的配置 应用感量为0.000 01 g的电子天平精确称量替米考星约0.002 00 g，用乙腈稀释定容至100 mL棕色容量瓶中，其浓度为：20μg/mL的标准储备液，保存在2～8℃的冰箱中，有效期为3个月。应用移液器精确吸取5.00 mL标准储备液，用流动相稀释定溶至10 mL容量瓶中，使其浓度为10μg/mL的标准工作液，现用现配。

磷酸二氢钾缓冲液：称取13.61 g磷酸二氢钾溶解于800 mL蒸馏水中，用磷酸调pH至2.5，再用蒸馏水稀释至1 000 mL；0.1 mol/L乙酸铵缓冲液（pH：5.0）：称取38.55 g乙酸铵，用蒸馏水溶解定容至1 000 mL，再用乙酸调节pH至5.0±0.2。

洗脱液（0.1 mol/L乙酸铵甲醇-乙腈，20+80，V/V）：称取7.71 g乙酸铵溶解于200 mL甲醇中，加790 mL乙腈混匀，冷却至室温，用乙腈稀释至1 000 mL[4]。

1.3.2 样品处理及提取 应用绞肉机将约500 g鸡肉样品全部充分绞碎，量取5.0±0.05 g肉样至50 mL聚乙烯离心管中，同法另取空白样品两份，其中一份空白样品添加替米考星标准品。每个离心管中加乙腈5.0 mL，应用蜗旋混合器将样品充分混匀1 min，超声波清洗器超声3 min，振荡器中速振荡5 min，10 000 r/min离心10 min，收集上清液于100 mL离心管中。组织残渣再依次加入5 mL磷酸二氢钾缓冲液和乙腈，应用蜗旋混合器将样品充分混匀3 min，振荡器中速振荡10 min，10 000 r/ min离心10 min，合并2次上清液，加水30 mL充分混匀待净化。

Cleaner t C18-SPE（500 mg/6 mL）固相萃取柱首先依次用甲醇、水各10 mL活化，上清液全部过柱，依次用10 mL水和乙腈淋洗，挤干。然后用洗脱液3.0 mL洗脱，挤干，收集洗脱液。将收集好的洗脱液于加热至30℃的氮吹仪吹干。用1 mL流动相将吹干物复溶，充分涡旋1 min，最后经0.5μm有机相微孔滤膜过滤，装瓶待上机。

1.3.3 色谱条件 色谱柱：Discovery C18（25 cm× 4.6 mm，5μm）色谱柱；流动相：0.1 mol/L乙酸胺缓冲液（乙酸调节至pH 5.0±0.2）-乙腈-甲醇=（60+ 30+10，V/V/V）；流速：1.0 mL/min；柱温：30± 5℃；进样体积：50μL；检测波长：290 nm。

2 结果与分析

2.1 计算公式

式中：X-样品中替米考星残留量（μg/kg），Ai-样品溶液中替米考星的峰面积，C-标准工作液中替米考星的浓度（μg/mL），V-试样定容体积（mL），f-样品稀释倍数，As-两个平行标准工作液中替米考星峰面积的平均值，M-样品的质量（g）。

2.2 标准品色谱图见图1。

图1 替米考星标准品高效液相色谱图Fig.1 HPLC chrom atogram of tilm icosin standards

由图1可以看出，替米考星组份的保留时间为14.518 min，其色谱峰分离完全，峰型狭窄、对称，无拖尾、分叉、前沿现象。说明色谱条件良好，流动相配比适中，色谱柱效能高，标准品有效未分解。

2.3 方法回收率、精密度、批内批间重复性和检出限 回收率（RC）公式为：RC=空白添加样品测定值/空白添加样品添加值×100%。每次试验附加1批次空白样品和1批次空白添加样品（添加量为已知），见图2、图3对照比较，其替米考星组分的保留时间为14.628 min。在相同条件下连续平行测定5次，根据5次结果计算相对偏差。结果见表1，另测定不同来源的4批次阴性鸡肉样品的加标回收率。每个样品平行测定5次，各个批次平均加标回收率均在70.5%～92.3%，批内和批间的相对偏差见表1，回收率最大相对偏差小于10.0%。以3倍信噪比（S/N）计算，该方法的检出限为10μg/kg。

图2 空白添加替米考星高效液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of tilm icosin of recoveries

表1 数据分析表Tab le1 Data ana lysis table

图3 空白样品高效液相色谱图Fig.3 HPLC chrom atogram o f the blank sam ple

2.4 样品结果分析见表2。

表2 鸡肉中替米考星药物残留情况Tab le2 Tilm icosin residues in chicken

从表2可以看出，64批次鸡肉样品共有5批次检出有替米考星药物残留，检出率7.8%。在检出的5批次样品中含量均未超过我国农业部第235号公告中对该类药物最高残留限量为75μg/kg的限量值。

3 讨论与结论

通过对64批次鸡肉样品中替米考星药物的检测可以看出，应用高效液相色谱法检测替米考星药物灵敏、高效、准确，便于批量检验。7.8%的高检出率表明此类药物在肉鸡养殖中应用普遍。有关部门应加强对肉鸡中抗生素残留的监测。5批次被检出样品均未超标，说明待宰动物都执行了休药期的规定。但是，低浓度的抗生素残留会很大程度上影响肉品质，也将会引发更多的抗药基因问题，对人类健康及生态环境造成潜在威胁。所以，有关部门应指导合理使用抗生素，严格控制动物使用抗生素的休药期，不定期监督抽样检测替米考星等抗生素的残留量。

[1]王煊，马志强，王忠仁.动物专用抗菌药—替米考星的简介[J].养殖技术顾问，2012，（4）：241.

[2]刘勇军.固相萃取-高效液相色谱法测定猪肉与鸡肉中替米考星、泰乐菌素残留量[J].肉类研究，2012，（12）：26.

[3]KOHANSKIMA，dePRISTO M A，COLLINSJJ.Sublethalantibiotic t reatment leads to mul tidrug resistance via radical-induced mutagenesis[J]. MolecularCel l，2010，37（3）：311-320.

[4]农业部1025号公告-10-2008.

（编辑：郭雪峰）

Determ ination and Analysis of tilm icosin Drug residue in chicken by HPLC

Cao Zhongjun
（Tieling Livestock Product Safety Inspection Station，Liaoning Tiel ing 11200）

Ti lmicosin drug residue were tested f rom 64 chicken samples col lected f rom urban areas using HPLC method.The resul ts showed that recoveries for each analyte in chicken ranged f rom 70.5%～92.3%.This method is fast and sensitive,and can be used to simul taneously analyze residual of quinolones in actual samples.There is a relevance ratio of ti lmicosin residue,therefore Authorities should take it seriously.

Ti lmicosin;Chicken;HPLC

S859.84

：B

：1672-9692(2014)10-0013-04

2014-08-28

曹忠君（1979-），男，硕士，畜牧师，主要从事畜产品兽药残留检测工作。