天然脱镁叶绿酸a提取技术和测定方法的研究进展

圣倩倩，祝遵凌，2

(1.南京林业大学风景园林学院，江苏南京 210037;2.南京林业大学艺术设计学院，江苏南京 210037)

卟啉类化合物是一类天然光敏活性剂［1］，在恶性肿瘤的诊断和光动力治疗中发挥了较为重要的作用［2-3］。而脱镁叶绿酸a(pheophorbide a)作为一种卟啉化合物，是高等植物和藻类的叶绿素中间代谢产物［4］，且已有相关报道脱镁叶绿酸a是一种光动力复合物［5-6］，可用于光动力疗法［7］。脱镁叶绿酸a是由叶绿素分子脱去镁离子后进一步水解而形成的化合物，具有显著的抗炎、抗肿瘤、保护胃肠粘膜等药理作用［8-10］。Stermitz等［11］证明了脱镁叶绿酸 a是一种强有力的外排泵抑制剂。Charles等［12］研究发现动物粪便中含有的脱镁叶绿酸a对肠原杆菌具有有效的外排泵抑制特性。

目前，脱镁叶绿酸a是叶绿素降解的中间产物，在茶叶、柑橘、老化叶中普遍存在，但含量低、分离困难，而其需求量日益加大，这就形成了供不应求的局面。本文综述了国内外近年来对脱镁叶绿酸a的提取技术和测定方法，常见的提取技术有丙酮法［13］、乙醇法［14-16］、丙酮-乙醇法、Hynninen 选择性酸法水解［17］、酸碱法［18］、甲醇法，测定方法有分光光度法、高效液相色谱法、薄层色谱分析法。旨在通过对脱镁叶绿酸a化合物提取方法和测定方法的总结和比较，找出其中的优缺点，以便能在以后的提取过程中发挥其优势，从而大大的提高提取效率，为以后脱镁叶绿酸a进一步研究、开发、应用提供依据。

1 天然脱镁叶绿酸a的提取方法

1.1 丙酮法

丙酮法是一种传统的提取方法。丙酮作为有机溶剂，提取绿色植物叶片中的粗品叶绿素，使用30%盐酸脱去金属离子和植醇长链，得到主要产物脱镁叶绿酸a。王章阳等［19］通过正交实验法优化丙酮法的工艺条件，2次提取蚕砂中的脱镁叶绿酸，70℃的提取温度，5 h以上的软化时间，1 h的提取时间，1/10倍干药材量的软化用量，3倍于药材量的溶媒用量，酸化，将pH调至2.5，60目的粉碎度，使得脱镁叶绿酸提取率提高了4.6倍。马士成［20］用水将蚕砂洗净后，自然风干，丙酮中回流提取，抽滤，收取滤液，浓缩近干，加乙醚、HCl混合液剧烈振摇后萃取，分离下层水溶液，加入冰块，用饱和NaOH将pH调至3左右，离心，沉淀即为脱镁叶绿酸a，离心液过滤后用EDTA滴定，测得脱镁叶绿酸a提取率为0.3%。

1.2 乙醇法

其原理是叶绿素分子为双羧酸的酯，一个为甲基所酯化，另一个为叶醇基所酯化，经皂化反应及酸化脱镁后，得到脱镁叶绿酸a。王章阳等［19］取中药材蚕砂50 g，加水软化，比例较少，用95%乙醇150 mL，10%NaOH调pH至12～13，70℃水浴提取1 h，测得提取率为0.072 6%。马士成用水将蚕砂洗净后摊晾近干，用95%乙醇和10%NaOH调pH，水浴提取，抽滤，收取滤液，浓缩，加水稀释浓缩液，振摇，用石油醚萃取下层皂化物至石油醚无色，下层皂化液加30%HCl调pH至3左右，离心，沉淀即为脱镁叶绿酸a。离心液过滤后用EDTA滴定，测得提取率0.07%。

对于丙酮法和乙醇法，王章阳和马士成一致认为丙酮法制备脱镁叶绿酸a的提取率高于乙醇法。且马士成认为提取的最佳条件为:提取2次，70℃的提取温度，5 h以上的软化时间，1 h的提取时间，1/10倍于原料的软化用量，3倍于原料的溶媒用量，酸化时调pH至2.5，60目的粉碎度，使得最后的提取率提高3.6倍。

1.3 丙酮-乙醇法

其原理是利用丙酮与乙醇按照不同比例混合作提取剂，将从绿色植物叶片中提取的叶绿素在强酸条件下脱去镁离子，生成脱镁叶绿酸。吴真等［21］认为对蚕砂软化时间2 h(含水量26%)、丙酮-乙醇(1∶2，v/v)作为提取叶绿素的溶剂效果最好，然后以蚕砂叶绿素粗品合成叶绿素衍生物脱镁叶绿酸，浓盐酸脱镁搅拌反应72 h，最后的脱镁叶绿酸a制备率达67%。而康玲等［22］则以蚕砂软化时间(含水量)、不同提取溶剂为考察条件，探讨浓盐酸脱镁时间对叶绿素合成脱镁叶绿酸制备率的影响，结果表明，蚕砂2 h(含水量26%)的软化时间、体积比1∶1的丙酮与乙醇作为提取叶绿素的溶剂效果最好，然后再使用蚕砂叶绿素粗品合成脱镁叶绿酸，浓盐酸脱镁搅拌反应72 h，制备率达670 mg/g。

1.4 Hynninen 选择性酸法水解［17］

由于叶绿素a与叶绿素b水解能力不同，以30%盐酸选择性地使叶绿素a植物醇基酯键水解，叶绿素b则不水解，以达到使二者分开的目的。使用糊状叶绿素，直接将叶绿素a水解成脱镁叶绿一酸a，经盐酸与乙醚按不同比例分离，获取脱镁叶绿一酸a，按Hynninen公式计算脱镁叶绿一酸的含量为88%。进一步使用薄层色谱法提纯，含量高达99%［18］。这种方法不仅提取效率高，而且所含杂质也较少。吴真等向蚕砂叶绿素粗品中直接加盐酸制备脱镁叶绿酸a，收率为67.3%，比常规工艺提高3倍多。

1.5 酸碱法

其原理是用浓度较高的盐酸水解叶绿素，主要得到脱镁叶绿一酸a，这表明脱镁叶绿素b的酯键对酸稳定，而叶绿素a的甲酯键和戊酮环也稳定。但碱水解叶绿素脱脂和开环很容易，但要提取脱镁叶绿二酸a和脱镁叶绿三酸a，需要设法控制碱的用量，而以碱法制备叶绿一酸a不易控制［18］。孙彩云［23］采用碱法水解制备脱镁叶绿酸，称量50 g蚕砂，加入30 mL水软化5 h以上，再加入提取剂丙酮(95%)与乙醇(1∶1)混合溶液200 mL，于45℃水浴锅中加热2 h，进行2次提取，然后过滤，将叶绿素提取液收集在烧瓶里，再加入10%NaOH溶液，将pH调至12左右，60℃水浴皂化回流1 h，然后减压蒸馏并回收溶剂。将皂化液用等体积的石油醚萃取3～5次，舍去上层黄色油相，收集下层水相(墨绿色皂化液)，搅拌并滴加20%HCl溶液，将pH调至2～3，再在45℃的水浴锅中加热30 min，产生的脱镁叶绿酸沉淀为深褐色。

1.6 甲醇法

Cheng等［24］利用甲醇提取爪哇大青中的脱镁叶绿酸a，再利用正己烷、氯仿和乙酸乙酯对甲醇提取物进行分馏，结合核磁共振波谱和脱镁叶绿酸a标准品进行分析，提取并测定脱镁叶绿酸a。使用这种方法虽然工艺比较简单，提取时间短，但提取物中含有的杂质较多，提取效率低。

2 天然脱镁叶绿酸a的测定方法

2.1 分光光度法

可见或紫外分光光度法都可用于测定溶液中脱镁叶绿酸a的含量。进行含量测定时选择脱镁叶绿酸a的最大吸收波长，这样做一方面灵敏度大，物质在含量上的稍许变化将引起较大的吸光度差异，另一方面可以避免其它物质的干扰。此外，分光光度法具有简便快捷，且对仪器设备要求不高等优点［25］。王永等［26］使用可见分光光度计测定大麦苗粉中脱镁叶绿酸a的含量时，根据脱镁叶绿酸可溶于乙醚的性质，以乙醚作对照，由于其在667 nm处有最大吸收蜂，故选定667 nm作为测定波长测定样品的吸光值。而Ewa Cieckiewicz等研究欧洲鹅耳栎叶片中的脱镁叶绿酸a，得出紫外/可见光谱在408 nm有一个很强的吸收峰，666 nm有一个较小的吸收峰。孙彩云［23］采用紫外-可见分光光度计(UVVis)扫描已提取的脱镁叶绿酸的吸收曲线。James等［27］通过对不同浓度的凉拌卷心菜提取液使用分光光度计进行测定，表明酸性条件下其提取液内的脱镁叶绿酸a含量较高。Frank等［28］利用可见光吸收光谱和核磁共振分析从茵陈蒿中提取出脱镁叶绿酸a。

2.2 高效液相色谱法

高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送(最高输送压力可达4.910 7 Pa);色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱(每米塔板数可达几万或几十万);同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。目前多使用制备型高效液相色谱法测定脱镁叶绿酸单体的含量，制备型高效液相色谱法具有制备量大、产率和纯度高、分离速度快等特点，但该方法由于在流动相中大多使用高浓度的缓冲盐或酸，对系统特别是液相柱损害较大。李洪玉等［29］采用HPLC法测定竹叶叶绿素衍生物脱镁叶绿酸a的含量时，填充剂:十八烷基硅烷键合硅胶，色谱柱:C18 diamonsil 5 μL(150 mm × 4.6 mm I.D)，流动相:MeOH-HAc(10∶0.1)，409 nm 的紫外检测波长，定量分析脱镁叶绿酸a，这种方法简单、快速、准确，适用于脱镁叶绿酸a含量的测定和质量控制。吴方评等［30］用90%丙酮振荡并提取烟草中含有的脱镁叶绿素，将提取液在Waters Sep-Park-C18固相萃取小柱上预分离和富集，固定相为Waters Xterra TM RP18(1.0 mm ×50 mm，2.5 m)色谱柱，流动相为(1+1)甲醇异丙醇溶液-水梯度，烟叶中的脱镁叶绿素将在其最大吸收波长下分离提取，最后通过色谱峰面积来计算含量。

2.3 薄层色谱法

薄层层析法也称薄层色谱法(thin-layer chromatography)，是快速分离和定性分析少量物料的一种非常重要的技术，常用TLC表示。TLC是色谱技术的一种。与经典的分离提纯手段(重结晶、升华、萃取和蒸馏等)相比，薄层色谱法具有微量、快速、分离效率高和灵敏度高等优点，但在分辨率及重现性等方面不如高效液相色谱法和气相色谱法，一般用作定性和半定量的手段［31］。Rf值的大小与展开剂的极性有很大关系，常用的展开剂有石油醚、四氯化碳、甲苯、二氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、水、乙酸等［32］。徐磊［33］通过采集香樟树叶，从中提取叶绿素，展开剂为四氯化碳、丙酮、甲酸(14∶7∶1)，使用薄层层析法(TLC)对脱镁叶绿酸 a进行纯化，进行定量分析。纪平雄等使用相关报道的薄层层析展开剂(四氯化碳∶丙酮∶甲酸 =70∶29∶1)在硅胶薄板上不能将蚕砂中含有的脱镁叶绿酸a成分分开，而使用比例为14∶7∶1时，该展开剂能有效地将脱镁叶绿酸a分开，效果明显优于相关报道的展开剂比例。而Ewa等以二氯甲烷和乙酸乙酯(9∶1)为展开剂对欧洲鹅耳栎的脱镁叶绿酸a进行分离和纯化的效果良好。说明展开剂的选择需要根据特定的植物性质而定。

3 结束语

本文总结出的几种提取脱镁叶绿酸a的方法虽然方法简单易行，但均比较传统，提取效率低，仍需要科研工作者进行进一步探索脱镁叶绿酸a的分离纯化方法，由于自然界含有脱镁叶绿酸a的药用植物种类数量繁多，作为植物次生代谢产物的一大类家族，具有光动力作用，是一种潜在的抗癌物质，具有广阔的应用前景。因此在未来的研究中对富含脱镁叶绿酸a结构的植物进行深入研究，以期能够与抗癌药物结合起来，共同促进人类生物医学方面的发展。

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