苏云金芽孢杆菌原生质体制备与再生研究

宋利丹　郑毅　周勇

摘 要：主要研究了菌龄、酶浓度、酶解时间和酶解温度对苏云金芽孢杆菌原生质体制备和再生的影响。通过正交试验确定了苏云金芽孢杆菌制备和再生的最佳条件，当酶浓度为1.0mg/mL，酶解时间为80min，酶解温度为30℃时，原生质体的制备率和再生率达到最高，分别为98.14%和58.14%。

关键词：苏云金芽孢杆菌；原生质体；制备；再生

中图分类号 S476.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）03-04-20-02

引言

基因组改组技术是近几年迅速发展的微生物育种技术，在菌种特性改良和提高产量等方面取得了一系列成果[1]。原生质体制备、再生与融合技术是基因组改组育种的重要技术基础，由于各种微生物细胞壁的组成和结构不同，不同菌种原生质体制备和再生的条件也不相同[2-3]，较高的原生质体制备率和再生率是育种成功的必要条件。本研究拟开展苏云金芽孢杆菌基因组改组菌种选育，通过酶解法制备苏云金芽孢杆菌原生质体，主要研究了菌龄、酶浓度、酶解时间、酶解温度对原生质体制备和再生的影响，优化出原生质体制备与再生的最佳条件，为进一步进行原生质体的融合、选育优良重组的菌株奠定基础。

1 材料

1.1 菌种 苏云金芽孢杆菌FS42，本实验室保藏。

1.2 培养基 （1）斜面（平板）培养基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20。pH7.0～7.2。

（2）再生培养基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20，蔗糖171.15。pH7.0～7.2。

（3）种子培养液（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化钠5。pH7.0～7.2。

2 方法

2.1 菌种活化 从保种斜面挑取一环，平板划线，37℃恒温培养箱放置24h。

2.2 种子培养 从活化的平板上挑取成熟的单菌落接入种子培养基（装液量50mL/250mL三角瓶），置于 30℃ 230r/min恒温摇床振荡培养11h。

2.3 原生质体制备与再生

2.3.1 原生质体的制备 （1）挑取成熟的单菌落接入液体培养基（装液量50mL/250mL三角瓶），置于30℃ 230r/min恒温摇床振荡培养11h，2%转接新鲜的液体培养基（装液量50mL/250mL三角瓶），恒温摇床振荡培养3h，加3%的甘氨酸，继续培养4h。（2）吸取3mL菌液，加入3mL0.75mg/mL溶菌酶液，40℃水浴低速振荡60min。（3）吸取0.1mL菌液，用无菌水稀释至一定梯度，吸取0.1mL涂于平板上，37℃培养24h，计算其菌落数（A值）。

2.3.2 原生质体的再生 （1）用高渗缓冲液将制备好的原生质体悬液稀释至一定梯度，吸取0.lmL涂于再生培养基，37℃培养24h，计算其菌落数（C值）。（2）吸取0.1mL制备好的原生质体悬液，用无菌水稀释至一定梯度，静置20min，使其充分胀破，最后吸取0.1mL涂于平板上，37℃培养24h，计算其菌落数（B值）。

2.3.3 制备率和再生率计算公式 （1）制备率（%）=（A-B）/A×100；（2）再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100。其中，A：总菌落数；B：未被酶解的菌数；C：原生质体再生菌数与未酶解菌总数。

3 结果与分析

3.1 单因素试验优化

3.1.1 溶菌酶浓度对原生质体制备与再生的影响 采用酶法制备苏云金芽孢杆菌FS42原生质，取预培养的菌液（接后培养3h，加3%甘氨酸，继续摇瓶培养4h），其它制备条件不变，溶菌酶浓度为0.5mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL，以考察不同浓度对原生质体制备与再生的影响，结果见图1。

从图1可以看出，当溶菌酶浓度为1.0mg/mL时，原生质体制备率达到最高，为82.63%，原生质体的制备率随酶浓度的增加而升高，但提高幅度较缓慢。当溶菌酶浓度为0.5mg/mL时，再生率达到最高，而随着酶浓度的增加，再生率逐渐下降，由12.1%下降至3.14%。由此可见，酶浓度的增加不利于原生质体的再生。虽然高浓度的酶制备率比较高，但再生率却很低。其原因可能是高浓度的溶菌酶使细胞壁被裂解得太彻底，进一步对原生质体产生毒害，使其失去再生能力，从而再生率下降。

3.1.2 酶解时间对原生质体制备与再生的影响 采用0.5mg/mL溶菌酶酶解，其它制备条件不变，分别酶解作用40min、60min、80min，考察不同酶解时间对原生质体制备与再生的影响，结果见图2。结果表明：酶解时间对其原生质体制备率和再生率有较大的影响。当酶解时间为60min，制备率与再生率的乘积达到最大，若继续延长裂解的时间，虽然制备率有略微上升，但其再生率快速下降，造成这种结果可能是因为：原生质体的形成需要一定的酶解时间，酶解时间太短，则形成的数量少，直接影响其再生率；若时间太长，酶活力显著下降且脱壁太彻底，使细胞壁失去再生的引物，对酶的损害也越大，使再生率大大降低[4]。

3.1.3 酶解温度对原生质体制备与再生的影响

采用酶解时间为60min，其它条件不变，考察35℃、40℃、45℃ 3个酶解温度对原生质体制备和再生的影响。由图3可知，随着温度的升高，制备率逐渐升高，但变化较为缓慢，酶解温度为45℃时，制备率达到最大，为99.76%。随着温度的升高，再生率逐渐下降。酶解温度为35～40℃，虽然制备率变化缓慢，但对再生率的影响非常明显，由17%下降至4.17%。根据酶的动力学性质可知，随着温度的升高，酶反应速度加快，但是酶反应的温度过高，则会导致酶的失活，而降低酶解的能力，同时破坏了原生质体的活性，造成原生质体再生率显著下降。

3.2 正交试验优化原生质体制备与再生条件 单因素优化结果表明，酶浓度、酶解时间、酶解温度对原生质制备与再生有重要影响，通过正交试验考察3因素对原生质体制备与再生的综合影响，采用3因素3水平试验设计，结果见表1。以原生质制备率为考察指标，正交极差分析表明，酶解浓度在原生质体制备中起主导作用。当温度为35℃、酶解浓度为1.0mg/mL、酶解时间为60min时，原生质体的制备率最高。以再生率为考察指标，正交极差分析表明，酶解温度在原生质体再生中起主导作用。当温度为30℃、酶解浓度为1.0mg/mL、酶解时间为80min时，原生质体的制备率均值最大，说明在这3个条件下，原生质体的制备效果最好。

综合单因素与正交试验可知，酶解浓度对原生质体制备影响最大，酶解温度对原生质体再生的影响最大。根据正交试验结果分析确定苏云金芽孢杆菌原生质体制备与再生的最优条件为：取转接后3h加甘氨酸，继续摇瓶培养4h的菌体，在1.0mg/mL的溶菌酶溶液中，30℃酶解80min，此条件下，制备率达98.14%，同时再生率也可达58.14%。

参考文献

[1]陈劲春，尉渤，周代福. 原生质体技术在工业微生物育种中的应用[J].工业微生物，1997（04）：37-39.

[2]李麒，武井直树. 纳豆在保健和医疗上的应用价值[J].中国微生态学杂志，2002（4）：57-60.

[3]刘新梅，高宇，赵静，等.纳豆菌原生质体制备与再生条件的研究[J].食品科学，2007（5）：231-236.

[4]刘伊强，王雅平，潘乃穟，等.芽孢杆菌原生质体的形成、再生及种间融合的研究[J].微生物学报，1994（1）：76-80.

[5]朱志春.基因组改组选育类球红细菌辅酶Q10高产菌株[D].福建师范大学，2012.

[6]乔宝义，徐浩.棒状杆菌原生质体的形成、再生以及融合的初步探讨[J].微生物学报，1983（1）：33-43.

[7]雷虹，曾伟民，金忠斌，等.小白链霉菌（Streptomyces Albulus）的原生质体制备研究[J].黑龙江大学自然科学学报，2007（3）：306-309.

（责编：施婷婷）

摘 要：主要研究了菌龄、酶浓度、酶解时间和酶解温度对苏云金芽孢杆菌原生质体制备和再生的影响。通过正交试验确定了苏云金芽孢杆菌制备和再生的最佳条件，当酶浓度为1.0mg/mL，酶解时间为80min，酶解温度为30℃时，原生质体的制备率和再生率达到最高，分别为98.14%和58.14%。

关键词：苏云金芽孢杆菌；原生质体；制备；再生

中图分类号 S476.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）03-04-20-02

引言

基因组改组技术是近几年迅速发展的微生物育种技术，在菌种特性改良和提高产量等方面取得了一系列成果[1]。原生质体制备、再生与融合技术是基因组改组育种的重要技术基础，由于各种微生物细胞壁的组成和结构不同，不同菌种原生质体制备和再生的条件也不相同[2-3]，较高的原生质体制备率和再生率是育种成功的必要条件。本研究拟开展苏云金芽孢杆菌基因组改组菌种选育，通过酶解法制备苏云金芽孢杆菌原生质体，主要研究了菌龄、酶浓度、酶解时间、酶解温度对原生质体制备和再生的影响，优化出原生质体制备与再生的最佳条件，为进一步进行原生质体的融合、选育优良重组的菌株奠定基础。

1 材料

1.1 菌种 苏云金芽孢杆菌FS42，本实验室保藏。

1.2 培养基 （1）斜面（平板）培养基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20。pH7.0～7.2。

（2）再生培养基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20，蔗糖171.15。pH7.0～7.2。

（3）种子培养液（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化钠5。pH7.0～7.2。

2 方法

2.1 菌种活化 从保种斜面挑取一环，平板划线，37℃恒温培养箱放置24h。

2.2 种子培养 从活化的平板上挑取成熟的单菌落接入种子培养基（装液量50mL/250mL三角瓶），置于 30℃ 230r/min恒温摇床振荡培养11h。

2.3 原生质体制备与再生

2.3.1 原生质体的制备 （1）挑取成熟的单菌落接入液体培养基（装液量50mL/250mL三角瓶），置于30℃ 230r/min恒温摇床振荡培养11h，2%转接新鲜的液体培养基（装液量50mL/250mL三角瓶），恒温摇床振荡培养3h，加3%的甘氨酸，继续培养4h。（2）吸取3mL菌液，加入3mL0.75mg/mL溶菌酶液，40℃水浴低速振荡60min。（3）吸取0.1mL菌液，用无菌水稀释至一定梯度，吸取0.1mL涂于平板上，37℃培养24h，计算其菌落数（A值）。

2.3.2 原生质体的再生 （1）用高渗缓冲液将制备好的原生质体悬液稀释至一定梯度，吸取0.lmL涂于再生培养基，37℃培养24h，计算其菌落数（C值）。（2）吸取0.1mL制备好的原生质体悬液，用无菌水稀释至一定梯度，静置20min，使其充分胀破，最后吸取0.1mL涂于平板上，37℃培养24h，计算其菌落数（B值）。

2.3.3 制备率和再生率计算公式 （1）制备率（%）=（A-B）/A×100；（2）再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100。其中，A：总菌落数；B：未被酶解的菌数；C：原生质体再生菌数与未酶解菌总数。

3 结果与分析

3.1 单因素试验优化

3.1.1 溶菌酶浓度对原生质体制备与再生的影响 采用酶法制备苏云金芽孢杆菌FS42原生质，取预培养的菌液（接后培养3h，加3%甘氨酸，继续摇瓶培养4h），其它制备条件不变，溶菌酶浓度为0.5mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL，以考察不同浓度对原生质体制备与再生的影响，结果见图1。

从图1可以看出，当溶菌酶浓度为1.0mg/mL时，原生质体制备率达到最高，为82.63%，原生质体的制备率随酶浓度的增加而升高，但提高幅度较缓慢。当溶菌酶浓度为0.5mg/mL时，再生率达到最高，而随着酶浓度的增加，再生率逐渐下降，由12.1%下降至3.14%。由此可见，酶浓度的增加不利于原生质体的再生。虽然高浓度的酶制备率比较高，但再生率却很低。其原因可能是高浓度的溶菌酶使细胞壁被裂解得太彻底，进一步对原生质体产生毒害，使其失去再生能力，从而再生率下降。

3.1.2 酶解时间对原生质体制备与再生的影响 采用0.5mg/mL溶菌酶酶解，其它制备条件不变，分别酶解作用40min、60min、80min，考察不同酶解时间对原生质体制备与再生的影响，结果见图2。结果表明：酶解时间对其原生质体制备率和再生率有较大的影响。当酶解时间为60min，制备率与再生率的乘积达到最大，若继续延长裂解的时间，虽然制备率有略微上升，但其再生率快速下降，造成这种结果可能是因为：原生质体的形成需要一定的酶解时间，酶解时间太短，则形成的数量少，直接影响其再生率；若时间太长，酶活力显著下降且脱壁太彻底，使细胞壁失去再生的引物，对酶的损害也越大，使再生率大大降低[4]。

3.1.3 酶解温度对原生质体制备与再生的影响

采用酶解时间为60min，其它条件不变，考察35℃、40℃、45℃ 3个酶解温度对原生质体制备和再生的影响。由图3可知，随着温度的升高，制备率逐渐升高，但变化较为缓慢，酶解温度为45℃时，制备率达到最大，为99.76%。随着温度的升高，再生率逐渐下降。酶解温度为35～40℃，虽然制备率变化缓慢，但对再生率的影响非常明显，由17%下降至4.17%。根据酶的动力学性质可知，随着温度的升高，酶反应速度加快，但是酶反应的温度过高，则会导致酶的失活，而降低酶解的能力，同时破坏了原生质体的活性，造成原生质体再生率显著下降。

3.2 正交试验优化原生质体制备与再生条件 单因素优化结果表明，酶浓度、酶解时间、酶解温度对原生质制备与再生有重要影响，通过正交试验考察3因素对原生质体制备与再生的综合影响，采用3因素3水平试验设计，结果见表1。以原生质制备率为考察指标，正交极差分析表明，酶解浓度在原生质体制备中起主导作用。当温度为35℃、酶解浓度为1.0mg/mL、酶解时间为60min时，原生质体的制备率最高。以再生率为考察指标，正交极差分析表明，酶解温度在原生质体再生中起主导作用。当温度为30℃、酶解浓度为1.0mg/mL、酶解时间为80min时，原生质体的制备率均值最大，说明在这3个条件下，原生质体的制备效果最好。

综合单因素与正交试验可知，酶解浓度对原生质体制备影响最大，酶解温度对原生质体再生的影响最大。根据正交试验结果分析确定苏云金芽孢杆菌原生质体制备与再生的最优条件为：取转接后3h加甘氨酸，继续摇瓶培养4h的菌体，在1.0mg/mL的溶菌酶溶液中，30℃酶解80min，此条件下，制备率达98.14%，同时再生率也可达58.14%。

参考文献

[1]陈劲春，尉渤，周代福. 原生质体技术在工业微生物育种中的应用[J].工业微生物，1997（04）：37-39.

[2]李麒，武井直树. 纳豆在保健和医疗上的应用价值[J].中国微生态学杂志，2002（4）：57-60.

[3]刘新梅，高宇，赵静，等.纳豆菌原生质体制备与再生条件的研究[J].食品科学，2007（5）：231-236.

[4]刘伊强，王雅平，潘乃穟，等.芽孢杆菌原生质体的形成、再生及种间融合的研究[J].微生物学报，1994（1）：76-80.

[5]朱志春.基因组改组选育类球红细菌辅酶Q10高产菌株[D].福建师范大学，2012.

[6]乔宝义，徐浩.棒状杆菌原生质体的形成、再生以及融合的初步探讨[J].微生物学报，1983（1）：33-43.

[7]雷虹，曾伟民，金忠斌，等.小白链霉菌（Streptomyces Albulus）的原生质体制备研究[J].黑龙江大学自然科学学报，2007（3）：306-309.

（责编：施婷婷）

摘 要：主要研究了菌龄、酶浓度、酶解时间和酶解温度对苏云金芽孢杆菌原生质体制备和再生的影响。通过正交试验确定了苏云金芽孢杆菌制备和再生的最佳条件，当酶浓度为1.0mg/mL，酶解时间为80min，酶解温度为30℃时，原生质体的制备率和再生率达到最高，分别为98.14%和58.14%。

关键词：苏云金芽孢杆菌；原生质体；制备；再生

中图分类号 S476.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2014）03-04-20-02

引言

基因组改组技术是近几年迅速发展的微生物育种技术，在菌种特性改良和提高产量等方面取得了一系列成果[1]。原生质体制备、再生与融合技术是基因组改组育种的重要技术基础，由于各种微生物细胞壁的组成和结构不同，不同菌种原生质体制备和再生的条件也不相同[2-3]，较高的原生质体制备率和再生率是育种成功的必要条件。本研究拟开展苏云金芽孢杆菌基因组改组菌种选育，通过酶解法制备苏云金芽孢杆菌原生质体，主要研究了菌龄、酶浓度、酶解时间、酶解温度对原生质体制备和再生的影响，优化出原生质体制备与再生的最佳条件，为进一步进行原生质体的融合、选育优良重组的菌株奠定基础。

1 材料

1.1 菌种 苏云金芽孢杆菌FS42，本实验室保藏。

1.2 培养基 （1）斜面（平板）培养基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20。pH7.0～7.2。

（2）再生培养基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化钠5，琼脂20，蔗糖171.15。pH7.0～7.2。

（3）种子培养液（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化钠5。pH7.0～7.2。

2 方法

2.1 菌种活化 从保种斜面挑取一环，平板划线，37℃恒温培养箱放置24h。

2.2 种子培养 从活化的平板上挑取成熟的单菌落接入种子培养基（装液量50mL/250mL三角瓶），置于 30℃ 230r/min恒温摇床振荡培养11h。

2.3 原生质体制备与再生

2.3.1 原生质体的制备 （1）挑取成熟的单菌落接入液体培养基（装液量50mL/250mL三角瓶），置于30℃ 230r/min恒温摇床振荡培养11h，2%转接新鲜的液体培养基（装液量50mL/250mL三角瓶），恒温摇床振荡培养3h，加3%的甘氨酸，继续培养4h。（2）吸取3mL菌液，加入3mL0.75mg/mL溶菌酶液，40℃水浴低速振荡60min。（3）吸取0.1mL菌液，用无菌水稀释至一定梯度，吸取0.1mL涂于平板上，37℃培养24h，计算其菌落数（A值）。

2.3.2 原生质体的再生 （1）用高渗缓冲液将制备好的原生质体悬液稀释至一定梯度，吸取0.lmL涂于再生培养基，37℃培养24h，计算其菌落数（C值）。（2）吸取0.1mL制备好的原生质体悬液，用无菌水稀释至一定梯度，静置20min，使其充分胀破，最后吸取0.1mL涂于平板上，37℃培养24h，计算其菌落数（B值）。

2.3.3 制备率和再生率计算公式 （1）制备率（%）=（A-B）/A×100；（2）再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100。其中，A：总菌落数；B：未被酶解的菌数；C：原生质体再生菌数与未酶解菌总数。

3 结果与分析

3.1 单因素试验优化

3.1.1 溶菌酶浓度对原生质体制备与再生的影响 采用酶法制备苏云金芽孢杆菌FS42原生质，取预培养的菌液（接后培养3h，加3%甘氨酸，继续摇瓶培养4h），其它制备条件不变，溶菌酶浓度为0.5mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL，以考察不同浓度对原生质体制备与再生的影响，结果见图1。

从图1可以看出，当溶菌酶浓度为1.0mg/mL时，原生质体制备率达到最高，为82.63%，原生质体的制备率随酶浓度的增加而升高，但提高幅度较缓慢。当溶菌酶浓度为0.5mg/mL时，再生率达到最高，而随着酶浓度的增加，再生率逐渐下降，由12.1%下降至3.14%。由此可见，酶浓度的增加不利于原生质体的再生。虽然高浓度的酶制备率比较高，但再生率却很低。其原因可能是高浓度的溶菌酶使细胞壁被裂解得太彻底，进一步对原生质体产生毒害，使其失去再生能力，从而再生率下降。

3.1.2 酶解时间对原生质体制备与再生的影响 采用0.5mg/mL溶菌酶酶解，其它制备条件不变，分别酶解作用40min、60min、80min，考察不同酶解时间对原生质体制备与再生的影响，结果见图2。结果表明：酶解时间对其原生质体制备率和再生率有较大的影响。当酶解时间为60min，制备率与再生率的乘积达到最大，若继续延长裂解的时间，虽然制备率有略微上升，但其再生率快速下降，造成这种结果可能是因为：原生质体的形成需要一定的酶解时间，酶解时间太短，则形成的数量少，直接影响其再生率；若时间太长，酶活力显著下降且脱壁太彻底，使细胞壁失去再生的引物，对酶的损害也越大，使再生率大大降低[4]。

3.1.3 酶解温度对原生质体制备与再生的影响

采用酶解时间为60min，其它条件不变，考察35℃、40℃、45℃ 3个酶解温度对原生质体制备和再生的影响。由图3可知，随着温度的升高，制备率逐渐升高，但变化较为缓慢，酶解温度为45℃时，制备率达到最大，为99.76%。随着温度的升高，再生率逐渐下降。酶解温度为35～40℃，虽然制备率变化缓慢，但对再生率的影响非常明显，由17%下降至4.17%。根据酶的动力学性质可知，随着温度的升高，酶反应速度加快，但是酶反应的温度过高，则会导致酶的失活，而降低酶解的能力，同时破坏了原生质体的活性，造成原生质体再生率显著下降。

3.2 正交试验优化原生质体制备与再生条件 单因素优化结果表明，酶浓度、酶解时间、酶解温度对原生质制备与再生有重要影响，通过正交试验考察3因素对原生质体制备与再生的综合影响，采用3因素3水平试验设计，结果见表1。以原生质制备率为考察指标，正交极差分析表明，酶解浓度在原生质体制备中起主导作用。当温度为35℃、酶解浓度为1.0mg/mL、酶解时间为60min时，原生质体的制备率最高。以再生率为考察指标，正交极差分析表明，酶解温度在原生质体再生中起主导作用。当温度为30℃、酶解浓度为1.0mg/mL、酶解时间为80min时，原生质体的制备率均值最大，说明在这3个条件下，原生质体的制备效果最好。

综合单因素与正交试验可知，酶解浓度对原生质体制备影响最大，酶解温度对原生质体再生的影响最大。根据正交试验结果分析确定苏云金芽孢杆菌原生质体制备与再生的最优条件为：取转接后3h加甘氨酸，继续摇瓶培养4h的菌体，在1.0mg/mL的溶菌酶溶液中，30℃酶解80min，此条件下，制备率达98.14%，同时再生率也可达58.14%。

参考文献

[1]陈劲春，尉渤，周代福. 原生质体技术在工业微生物育种中的应用[J].工业微生物，1997（04）：37-39.

[2]李麒，武井直树. 纳豆在保健和医疗上的应用价值[J].中国微生态学杂志，2002（4）：57-60.

[3]刘新梅，高宇，赵静，等.纳豆菌原生质体制备与再生条件的研究[J].食品科学，2007（5）：231-236.

[4]刘伊强，王雅平，潘乃穟，等.芽孢杆菌原生质体的形成、再生及种间融合的研究[J].微生物学报，1994（1）：76-80.

[5]朱志春.基因组改组选育类球红细菌辅酶Q10高产菌株[D].福建师范大学，2012.

[6]乔宝义，徐浩.棒状杆菌原生质体的形成、再生以及融合的初步探讨[J].微生物学报，1983（1）：33-43.

[7]雷虹，曾伟民，金忠斌，等.小白链霉菌（Streptomyces Albulus）的原生质体制备研究[J].黑龙江大学自然科学学报，2007（3）：306-309.

（责编：施婷婷）