葛根素预处理对缺血再灌注心肌脂质过氧化与内质网应激的影响

冯毅马亚飞张林波王晓峰魏丽娟

葛根素预处理对缺血再灌注心肌脂质过氧化与内质网应激的影响

冯毅①马亚飞①张林波①王晓峰①魏丽娟①

目的：观察葛根素预处理对缺血再灌注（I/R）大鼠心肌内质网应激（ERS）与细胞凋亡的影响。方法：采用随机数字表法将24只大鼠分为假手术组（SH组），缺血再灌注组（I/R组），葛根素预处理组（PU组）三组，每组8只。实验结束测定心肌丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）的含量以及GRP78 mRNA、CRT mRNA的表达。结果：与SH组比较，其余两组GRP78 mRNA与CRT mRNA表达、心肌MDA含量均明显增加，而心肌SOD水平明显降低（P＜0.05）。与I/R组比较，PU组GRP78 mRNA与CRT mRNA表达、心肌MDA含量均降低，且心肌SOD水平明显增加（P＜0.05）。结论：葛根素预处理可能通过减轻心肌脂质过氧化反应，抑制I/R导致的过度ERS而发挥心肌保护作用。

葛根素； 缺血再灌注； 内质网应激； 脂质过氧化

心肌缺血再灌注（I/R）过程中由于钙超载、脂质过氧化、缺氧等多种因素可导致内质网应激（ERS），适当的ERS可诱导多种保护蛋白表达上调，增强细胞对缺血再灌注损失的耐受能力，但持续而严重的ERS则诱发内质网凋亡信号通路导致细胞凋亡和组织损伤[1-2]。研究表明葛根素（puerarin，Pue）可以通过多种途径减轻I/R导致的心肌损伤[3-4]。因此，本研究通过复制大鼠心肌缺血再灌注损失实验模型，探讨葛根素对缺血再灌注心肌脂质过氧化和ERS的影响。

1 资料与方法

1.1 动物及试剂 健康雄性SD大鼠24只（重庆医科大学实验动物中心），葛根素注射液（浙江康恩贝制药股份有限公司），PCR试剂盒（北京天根产品），总RNA提取及逆转录试剂盒（Takara公司），丙二醛（Malondialdehyde， MDA）和超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase， SOD）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 实验分组 雄性SD大鼠24只按照随机数字表法分成三组，每组8只。假手术组（SH组）：开胸后，在冠状动脉左前降支下穿线但不结扎，在穿线前15 min经颈静脉注射生理盐水（2.5 mL/kg），连续观察150 min。缺血再灌注组（I/R组）：在结扎冠状动脉左前降支前15 min经颈静脉注射生理盐水（2.5 mL/kg），结扎30 min，再开放120 min[5-6]。葛根素预处理组（PU组）：结扎前15 min经颈静脉注射Pue（2.5 mL/kg），余同I/R组[7]。

1.3 测定指标 将心肌细胞研磨成匀浆，以3000 rpm离心15 min，吸取上清液置管封存冷冻。运用硫代巴比妥酸法测定心肌组织MDA含量，分光光度计法测定心肌组织SOD活性，并参考文献[7]行RT-PCR检测心肌组织葡萄糖调节蛋白78（GRP78）和钙网蛋白（CRT）mRNA的表达。

1.4 统计学处理 采用SPSS 16.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 葛根素预处理对心肌MDA、SOD水平的影响 与SH组比较，其余两组心肌MDA含量显著增多，SOD水平明显降低（P＜0.05）。与I/R组比较，PU组心肌MDA含量减少，SOD活性升高（P＜0.05）。见表1。

表1 葛根素预处理对心肌MDA、SOD和GRP78 mRNA、CRT mRNA表达水平的影响（±s）

表1 葛根素预处理对心肌MDA、SOD和GRP78 mRNA、CRT mRNA表达水平的影响（±s）

*与SH组比较，P＜0.05；△与I/R组比较，P＜0.05.

组别 MDA（nmol/mgprot） SOD（U/mgprot） GRP78 mRNA CRT mRNA SH组（n=8） 0.76±0.21 54.25±3.39 0.59±0.05 0.56±0.04 I/R组（n=8） 1.12±0.42* 35.27±5.74* 0.96±0.07* 0.91±0.05*PU组（n=8） 0.89±0.35*△ 45.03±4.16*△ 0.77±0.06*△ 0.72±0.06*△

2.2 葛根素预处理对心肌GRP78、CRT mRNA水平的影响 与SH组比较，I/R组、PU组GRP78、CRT mRNA表达水平均增高（P＜0.05）；与I/R组比较，PU组GRP78、CRT mRNA表达水平降低（P＜0.05）。见表1。

3 讨论

氧自由基大量产生并通过过氧化反应造成组织细胞损伤是I/R损伤的主要机制之一，主要损害为细胞膜不饱和脂肪酸的过氧化反应，产生脂质过氧化物，使生物膜结构受到严重损害。MDA是细胞内发生脂质过氧化反应的终产物，是反映体内氧化应激反应的重要指标之一，其含量多少可反映细胞膜脂质过氧化的程度，可间接反映细胞损伤程度[8]。SOD是广泛存在于需氧物体内的一种金属酶，能催化超氧阴离子自由产生歧化反应，是体内最为重要的自由基清除剂[9]。研究表明葛根素可减轻心肌脂质过氧化和钙超载损失，提高氧自由基清除能力，改善组织微循环，提高心肌细胞能源储备达到对心肌I/R损伤的保护作用[5-6]。本实验显示，与I/R组比较，PU组脂质过氧化产物MDA生成减少、自由基清除酶SOD活性上调，提示葛根素可减轻脂质过氧化反应。

内质网是真核细胞中重要的细胞器之一，在调节蛋白质合成、折叠、降解和分泌，以及调节细胞应激反应等方面具有重要作用。I/R过程中由于钙超载、脂质过氧化、缺氧等多种因素均可致内质网内未折叠或错误折叠蛋白质的聚集、内质网功能障碍、钙稳态失衡等，即触发ERS[1]。ERS可通过三条信号途径诱发应激反应，其中未折叠蛋白反应途径（unfolded protein response，UPR）是发现较早、了解较多的一条ERS途径，UPR是由一个内质网分子伴侣GRP78和3个内质网应激感受蛋白所传导的。ERS时，使GRF78从3种内质网应激感受蛋白上解离，与内质网内堆积的未折叠蛋白结合，促进其折叠和降解。GRF78解离后，使无活性的ER应激感受蛋白被激活并启动UPR，进一步减少未折叠或错误折叠蛋白的积累，促进内质网正常功能的恢复。3个ER应激感受蛋白不仅能够启动ERS的生存途径，严重或长时间的ERS将诱发细胞凋亡途径，加速细胞凋亡[1]。GRP78 是ERS的标志性分子伴侣蛋白，其急速上调被认为是ERS最敏感的标志[10]。CRT是ER内重要的钙结合蛋白，参与协助蛋白质转运以及正确折叠，维持细胞内钙稳态、减轻细胞凋亡等[11]。本研究显示，I/R组与PU组均使GRP78和CRT mRNA表达上调，而PU组升高幅度较I/R组低，即PU组可诱导GRP78和CRT mRNA表达轻度增加，表明葛根素预处理可减轻I/R导致的过度ERS，进而减轻心肌细胞损失。

研究表明应用外源性SOD和过氧化氢酶作用于大鼠I/R心肌，发现其可改善内质网功能，提高细胞对钙的处理能力，表明抑制脂质过氧化反应是保护内质网功能、减轻过度ERS的一种重要机制[12]。而本研究显示，PU组脂质过氧化产物MDA生成减少、自由基清除酶SOD活性上调，且GRP78和CRT mRNA表达轻度增加，表明葛根素预处理可能通过减轻脂质过氧化反应，缓解I/R激发的过度ERS。

综上所述，葛根素预处理可能通过减轻心肌脂质过氧化反应，抑制I/R导致的过度ERS而发挥心肌保护作用。

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Effects of Puerarin on Ischemia/Reperfusion Myocardial Lipid Peroxidation and Endoplasmic Reticulum Stress in Rats

/FENG Yi，MA Ya-fei，ZHANG Lin-bo，et al.//Medical Innovation of China，2014，11（08）：011-012

Objective：To investigate the effect of endoplasmic reticulum stress （ERS） and apoptosis during myocardium ischemia reperfusion with Puerarin preconditioning in rats.Method：Twenty-four Male SD rats were divided randomly into three groups（n=8），sham operation group（SH），ischemia reperfusion group（IR） and Puerarin preconditioning group（PU）.The myocardial injury of rats ware produced by the ligation of left coronary artery for 30 min followed by 120 min reperfusion.The Malondialdehyde （MDA）， Superoxide Dismutase（SOD）， glucose-regulated protein 78 （GRP78） mRNA and calreticulin （CRT） mRNA were measured at the end of reperfusion.Result：Compared with the SH group， the expressions of MDA， GRP78 and CRT mRNA of the other two groups increased significantly （P＜0.05）， while the level of SOD decreased markedly （P＜0.05）. Compared with the I/R group， the level of MDA， GRP78 and CRT mRNA were significantly lower in PU group （P＜0.05）， while the level of SOD increased significantly（P＜0.05）.Conclusion：Preconditioning with puerarin may regulate ERS response and inhibit excessive ERS by reducing lipid peroxidation during myocardial ischemia reperfusion.

Puerarin； Ischemia-reperfusion； Endoplasmic reticulum stress； Lipid peroxidation

10.3969/j.issn.1674-4985.2014.08.005

2013-11-11） （本文编辑：黄新珍）

①河南科技大学附属第一医院 河南 洛阳 471000

马亚飞

First-author’s address： The First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology，Luoyang 471000，China