树莓与蓝莓中多酚类成分的HPLC测定

2014-03-11 07:03孟实张晓书赵余庆
食品研究与开发 2014年3期
关键词:花酸原儿茶酸矢车菊

孟实,张晓书,赵余庆,*

(1.九州大学农学部应用生物,日本福冈812-0053;2.沈阳药科大学中药学院,辽宁沈阳110016)

树莓与蓝莓中多酚类成分的HPLC测定

孟实1,张晓书2,赵余庆2,*

(1.九州大学农学部应用生物,日本福冈812-0053;2.沈阳药科大学中药学院,辽宁沈阳110016)

利用HPLC法对树莓与蓝莓中的生理活性成分进行含量测定。HPLC法采用Kromasil C18色谱柱(150mm,4.6mm);流动相采用色谱纯乙腈(A)-含0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脱,0~16min,5%A;19min,10%A;23min,13%A;40min,14%A;43min,17%A;48min,22%A;51min,24%A;52min,24%A;58min,26%A;60min,30%A;65min,60%A;68min,70%A;72min~78min,100%A;流速为1mL/min;柱温30℃;检测波长为280 nm;每次进样10μL,测定树莓与蓝莓95%乙醇提取物中没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、矢车菊素、鞣花酸、树莓酮、白藜芦醇、水杨酸的含量;这十种多酚类成分在三种浆果中含量高低不等,其中鞣花酸含量在黑树莓中最高(0.97μg/g),红树莓次之(0.51μg/g),蓝莓最低(0.36μg/g)。蓝莓与树莓中富含多种多酚类物质,是其具有多种生物活性的物质基础。

蓝莓;红树莓;黑树莓;HPLC

树莓属蔷薇科悬钩子属植物,果实酸甜可口,具有很高的营养价值,涩精益肾助阳明目、醒酒止渴、化痰解毒之功效,主治肾虚、遗精、醉酒、丹毒等症。叶性微苦,具有清热利咽、解毒、消肿、敛疮等作用,主治咽喉肿痛、多发性脓肿、乳腺炎等症,在湖南湘西地区,群众常将嫩叶捣碎饲喂动物治疗腹泻。同时,树莓中含有人体所必需的大量的VC、VE、SOD等营养物质,能改善人体新陈代谢及增强免疫力,有很高的药用价值。树莓的果实除鲜食外还大部分制成速冻果实、果汁、果酒和果酱等食品,是国内近年兴起的第3代水果之一[1]。红树莓较为常见,其热量较低,膳食纤维含量较高,树莓籽中不饱和脂肪酸含量较高,籽中含有脂溶性维生素如胡萝卜素和生育酚,果肉中含有水溶性VC。黑树莓作为近来日益流行的品种含有的生物活性的化学物质种类繁多,其中最为主要的是天然酚酸类成分。它们芳香环上都连有羟基,是植物次生代谢产生的非营养成分。蓝莓为越橘属,约有450种,主要者约18种,分布于全世界亚寒带、温带及亚热带。中国的大、小兴安岭山区有野生蓝莓,近年已进行人工驯化栽培。而源生于北美洲者泛称美国蓝莓,约百年前由F.V.Coville开始人工栽培[2]。尽管测定方法各不相同,浆果的抗氧化能力一直居各类水果之首,大约是其他水果的4倍,蔬菜的40倍。该浆果类植物中主要的活性物质有黄酮、酚醛酸、木脂素和单宁四类。本课题组对其可能存在的十种活性成分进行了含量测定。儿茶素和表儿茶素具有抗氧化、防辐射、护肤美容、减缓香烟毒害等多种功效[3]。在对鼠和人体组织移植所做的体内和体外试验中,鞣花酸表现出对化学物质诱导癌变及其他多种癌变有明显的抑制作用[4]。纯天然水果中的鞣花酸能仅将体内坏细胞摧毁,不会损伤体内好细胞。所以平常摄取此营养素可以预防癌细胞的形成,也是抗癌的最佳天然补充食品。白藜芦醇具有预防心血管病,抗肿瘤,抑制血小板凝集,延缓衰老等功效[5-8]。本研究对树莓和蓝莓中没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、矢车菊素、鞣花酸、树莓酮、白藜芦醇、水杨酸的多酚类含量进行系统全面的测定,以对以上几种水果的多酚类含量提供有效的参考。

1 材料与方法

1.1 样品前处理

取蓝莓、红树莓和黑树莓冻干粉各40 g,分别两次加入400mL的95%乙醇超声波提取,提取液经旋转蒸发后取适量经滤膜过滤待用。

1.2 试剂与仪器设备

高效液相色谱仪(L-2200Hitachi:日本);旋转蒸发仪(OSB-2000 EYELA:日本);Sartorius电子天平:中国。

没食子酸、原儿茶酸、矢车菊素、原花青素B2、白藜芦醇、鞣花酸、水杨酸和树莓酮对照品(质量分数均为98%)由天津市尖峰天然产物研究开发有限公司提供,儿茶素(批号878-200102)、表儿茶素对照品(批号877-200001)由中国药品生物制品检定所提供。甲醇为色谱纯、乙腈为色谱纯、双重蒸馏水。蓝莓和树莓的产地见表1。

表1 蓝莓和树莓的产地Table1 The products of blueberry and raspberries

1.3 测定方法

没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、矢车菊素、鞣花酸、树莓酮、白藜芦醇、水杨酸的测定,液相条件如下:

Kromasil C18色谱柱(150mm,4.6mm);流动相采用色谱纯乙腈(A)-含0.1%磷酸水溶液(B)梯度洗脱,0~16min,5%A;19 min,10%A;23min,13%A;40 min,14%A;43min,17%A;48min,22%A;51min,24%A;52min,24%A;58min,26%A;60min,30%A;65min,60%A;68min,70%A;72~78min,100%A;流速为1mL/min;柱温30℃;检测波长为280 nm;每次进样10μL。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

标准曲线没食子酸:1.0mg;原儿茶酸:1.3mg;儿茶素:0.8mg;表儿茶素:1.2mg;原花青素B2:0.8mg;矢车菊素:0.5mg;鞣花酸:1.3mg;树莓酮:1.2mg;白藜芦醇:1.1mg;水杨酸:1.4mg置于5mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。没食子酸标准曲线y=2E+06x-273 975 R2=0.9965结果表明,没食子酸在0.2μg~2.8μg线形关系良好。原儿茶酸标准曲线y=788910x-111788R2=0.9998结果表明,原儿茶酸在0.2μg~2.8μg线形关系良好。儿茶素标准曲线y=540 822x-73 815 R2=0.999 7结果表明,儿茶素在0.2μg~2.8μg线形关系良好。表儿茶素标准曲线y=602 376x-99 405R2= 0.999 4结果表明,表儿茶素在0.2μg~2.8μg线形关系良好。原花青素B2标准曲线y=85 567x-57 927,R2= 0.999 1结果表明,原花青素B2在0.2μg~2.8μg线形关系良好。

矢车菊素标准曲线y=293 173x-66 482 R2= 0.999 7结果表明,矢车菊素在0.2μg~2.8μg线形关系良好。鞣花酸标准曲线y=994 654x-213 775 R2= 0.999 7结果表明,鞣花酸在0.2μg~2.8μg线形关系良好。树莓酮标准曲线y=469 659x-120 798R2=0.999 7结果表明,树莓酮在0.2μg~2.8μg线形关系良好。白藜芦醇标准曲线y=285 053x-36 380 R2=0.999 1结果表明,白藜芦醇在0.2μg~2.8μg线形关系良好。水杨酸标准曲线y=2E+06x-104 852R2=0.999 4结果表明,水杨酸在0.2μg~2.8μg线形关系良好。

2.2 方法学考察

2.2.1 精密度试验

精密称取黑树莓提取物10μL连续进样5次,测定色谱峰面积。结果显示没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、矢车菊素、鞣花酸、树莓酮、白藜芦醇、水杨酸的平均RSD%分别为0.54%、0.51%、0.65%、0.67%、1.32%、0.69%、1.39%、1.66%、0.78%、0.48%。

2.2.2 重复性试验

精密称取黑树莓提取物10μL共5份,进样,测定色谱峰面积。结果显示白藜芦醇、食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、矢车菊素、鞣花酸、树莓酮、白藜芦醇、水杨酸的平均RSD%分别为1.25%、1.32%、1.41%、1.02%、1.08%、1.05%、1.38%、1.43%、1.06%和1.56%,表明本试验测定方法的重复性良好。

2.2.3 稳定性试验

分别在0、4、8、12、24 h精密吸取黑树莓提取物10μL进样,测定色谱峰面积。结果显示没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、矢车菊素、鞣花酸、树莓酮、白藜芦醇及水杨酸的平均RSD%分别为0.96%、1.62%、1.33%、1.29%、0.78%、1.21%、1.43%、1.89%、1.12%和0.99%,表明在此时间内供试品溶液性质稳定。

2.2.4 加样回收率试验

精取黑树莓提取物,共5份,分别加入0.05mg的没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、矢车菊素、鞣花酸、树莓酮、白藜芦醇及水杨酸对照品,分别精密吸取10μL进样,测定,平均回收率分别为100.72%、99.63%、100.97%、100.78%、100.11%、99.89%、100.56%、100.55%、100.79%、100.71%。RSD%分别为1.62%、1.08%、0.83%、1.02%、1.22%、1.45%、1.24%、0.97%、0.88%、1.78%。

2.2.5 HPLC测定结果

样品中没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、表儿茶素、原花青素B2、矢车菊素、鞣花酸、树莓酮、白藜芦醇、水杨酸含量见表1取酒样经0.22μm滤膜超滤备用。取对照品和供试品溶液进样测定,色谱图见图1。定量方法采用外标法,结果见表2。

从表2中可以看出,十种单体成分平均回收率在95%~110%,变异系数小于5%。该方法满足了定性和定量测定的需要。

图1 对照品(A)和黑树莓(B)的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and black raspberry(B)

表2 黑树莓、红树莓和蓝莓的HPLC含量测定结果Table2 HPLC determination results of ten compounds in black raspberry,red raspberry and blueberry μg/g

3 结论与讨论

树莓与蓝莓作为一种风味品质优良、营养价值高的小浆果,具有较高营养保健价值和经济价值,富含在其他水果中含量少或不含的特殊营养成分,在欧美等国家受到普遍欢迎,已经逐渐发展成为第三代新兴水果,具有很高的经济效益。由测定数据显示,儿茶素含量蓝莓最高(190.43μg/g),黑树莓(11.76μg/g),红树莓最低(4.81μg/g)。没食子酸含量黑树莓最高(1.02μg/g),红树莓之(0.14μg/g)蓝莓最低(0.01μg/g)。表儿茶素含量红树莓最高(1.94μg/g),蓝莓次之(1.12μg/g),黑树莓最低(0.69μg/g),鞣花酸含量黑树莓最高(0.97μg/g),红树莓次之(0.51μg/g),蓝莓最低(0.36μg/g)。鞣花酸是被科学家广泛认同的具有抑制致癌物质活性的成分,从数据可以看出其含量在黑树莓中最高,这也说明黑树莓对于肿瘤的预防具有一定的前景。但根据液相谱图可以看出,除此几种成分以外,仍有其他成分存在,对于这些成分的鉴别以及药理活性等相关研究工作正在进行中。

[1]陈介甫,李亚东,徐哲.蓝莓的主要化学成分及生物活性[J].药学学报,2010,45(4):422-429

[2]刘孟军.中国野生果树[M].北京:中国农业出版社:1998:227-231

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Analysis of Phenolic Compounds in Blue Berry and Raspberry by HPLC

MENG Shi1,ZHANG Xiao-shu2,ZHAO Yu-qing2,*
(1.Department of Applied Biology,Faculty of Agriculture,Kyushu University,Fukuoka,812-0053,Japan;2.Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang110016,Liaoning,China)

To assay the quantity of activities from blue berry and raspberry by absorption spectrometry and HPLC. The content of Gallic acid,protocatechuic acid,catechin,epicatechin,procyanidin B2,cyanidin,ellagic acid,raspberry ketone,resveratrol and salicylic acid were determined by HPLC analysis was detected by chromatography on Kromasil C18(4.6mm×150mm)chromatographic column.The mobile phase was chromatographic purity acetonitrile(A)-water solution containing 0.1%phosphoric acid(B)gradient elution,0-16min,5%A;19min,10%A;23min,13%A;40min,14%A;43min,17%A;48min,22%A;51min,24%A;52min,24%A;58min,26%A;60min,30%A;65min,60%A;68min,70%A;72min-78min,100%A,flow rate was 1mL/minatλ280nm.The content of phenolic compounds in these three kinds of berry was different.The content of ellagic acid from high to low order:black raspberry(0.97μg/g),red raspberry(0.51μg/g),blueberry(0.36μg/g). Blue berry and raspberry are particularly rich in phenolic compounds,which were the basics of their biological active diversity.

blueberry;red raspberry;black raspberry;HPLC

10.3969/j.issn.1005-6521.2014.03.022

2013-01-04

孟实(1989—),男(汉),硕士研究生,主要从事功能食品研究。

*通信作者:赵余庆(1957—),男(汉),教授,博士生导师,主要从事功能食品研究。

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