杜仲内生真菌ER12次生代谢产物研究

田从丽

(陕西国际商贸学院医药学院，陕西咸阳 712046)

内生菌是指在其生活史中的某一段时期，生活在植物组织细胞间隙或者植物组织细胞内，对其宿主植物组织器官不会引起明显的病害症状的菌物。其既包含了某些腐生菌、也包含了潜伏性病原菌以及菌根菌[1]。内生真菌在与宿主植物共生与进化的相互作用过程中，不仅可以从宿主植物中吸收自身生长过程不可或缺的营养物质，而且也可通过产生一些具有生理活性且对其宿主植物产生一定的积极作用次生代谢产物[2]。杜仲(Eucommiaulmoides)是杜仲科(Eucommiaceae)杜仲属(Eucommia)植物，为我国特有的珍贵树种。其树皮经过干燥可入药，是我国名贵的滋补药材。《神农本草经》、《本草纲目》均把杜仲列为中上品，并明确记载了其功效：“主治腰脊疼，补中，益精气，坚筋骨，强志，除阴下痒湿，小便余沥，安胎，久服轻身不老”[3]。笔者对杜仲内生真菌ER12的发酵物进行了化学成分研究，旨在为科学利用杜仲及其内生真菌提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1供试菌株。内生真菌ER12，从采自陕西杨凌的植物杜仲的根部分离得到。

1.1.2主要仪器。X-6熔点测定仪(温度计为校正)，购自北京华威兴业科技有限公司；核磁共振波谱仪(400MHz)，购自德国bruker公司。

1.1.3主要试剂。薄层色谱和柱层析硅胶(200～300目)，均为青岛海洋化工厂；其余溶剂与试剂均为分析纯，购自天津市富宇精细化工有限公司。

1.2方法

1.2.1培养基的制备。菌种以PDA培养基培养，4 ℃保存。发酵培养基为查氏培养基：蔗糖3 g，NaNO30.3 g，K2HPO40.1 g，KCl 0.05 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，FeSO40.001 g，蒸馏水100 ml，pH 7.0。

1.2.2发酵。采用平板划线法，将内生真菌ER12用接种针接种到新鲜PDA平板上，在28 ℃下培养3～5 d，无菌操作下，用无菌打孔器(直径=0.6 cm)将平板内的内生真菌打孔；取菌饼接种至含约500 ml察氏液体培养基1 000 ml锥形瓶中，每瓶接4～5个菌饼。与此同时留取空白培养基作对照。于29.5 ℃、130 r/min摇床上振荡培养12 d。

1.2.3提取分离。培养液用乙酸乙酯反复萃取，菌丝体用无水甲醇浸泡；粗提物经除糖处理后上硅胶柱，用乙酸乙酯-甲醇、石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集各组分再经反复柱层析和重结晶方法纯化，共分离得到化合物1(23 mg)、化合物2(34 mg)、化合物3(25 mg)和化合物4(31 mg)。

1.2.4化合物鉴定。通过核磁共振等波谱方法对分离得到的化合物进行结构鉴定。

2 结果与分析

2.1化合物1化合物1：化学式C10H20O6，无色针状结晶，易溶于甲醇和水，m.p.152～154 ℃。1HNMR(D2O) δ：0.90(3H，m，CH3)，1.36(2H，m，CH2-9)，1.55(2H，m，CH2-8)，3.51(2H，m，CH2-7)，3.71(1H，dd，Ha-6)，3.84(1H，dd，Hb-6)，3.78(2H，s，H-1)，3.91(2H，br,s，H-4,5)，3.98(1H，br,s，H-3)。13C-NMR δ：60.9(C-1)，100.1(C-2)，67.9(C-3)，68.8(C-4)，69.3(C-5)，60.9(C-6)，60.5(C-7)，31.0(C-8)，18.5(C-9)，12.8(C-10)。以上数据与文献对照基本一致，故确定该化合物为正丁基-β-D-吡喃果糖苷[4]。

2.2化合物2化合物2：白色粉末，可溶于甲醇，m.p.166～168 ℃。1H-NMR(DMSO)δ：4.41(2H，d，3-OH，4-OH)，4.31(2H，t，1-OH，6-OH)，4.12(2H，d，2-OH，5-OH)，13C-NMR(DMSO)δ：71.76(2，3-C)，70.12(3，4-C)， 64.32(1，6-C)。以上数据与文献对照基本一致，故确定该化合物为甘露醇[5]。

2.3化合物3化合物3：白色针状晶体，溶于氯仿，熔点：240～242 ℃。 1H-NMR(CDCl3)δ：δ0.60(3H，s，H-18)，δ0.82(3H，d，H-26)，δ0.84(3H，d， H-27)，δ0.91(3H，d， H-28)，δ1.03(3H，d， H-21)，δ1.09(3H，s，H-19)为6个甲基氢信号，(1H，dd，H-7)，δ5.17(1H，dd，H-22)，δ5.23(1H，dd，7.5，H-23)为3个双键的烯氢信号，δ 3.65(1H，d，J=4.79，H-6)，δ4.08(1H，m，H-3)为连氧碳上的氢信号。13C-NMR(CDCl3)δ：32.83(C-1)，30.63(C-2)，67.48(C-3)，39.65(C-4)，82.92(C-5)，76.39(C-6)，115.09(C-7)，143.95(C-8)，43.73(C-9)，37.41(C-10)，22.28(C-11)，39.64(C-12)，43.98(C-13)，55.16(C-14)，23.20(C-15)，28.79(C-16)，56.28(C-17)，12.47(C-18)，18.35(C-19)，40.77(C-20)，19.76(C-21)，132.32(C-22)，135.68(C-23)，43.18(C-24)，33.38(C-25)，19.76(C-26)，21.27(C-27)，17.77(C-28)。以上数据与文献对照基本一致，故确定该化合物为啤酒甾醇[6]。

2.4化合物4化合物4：白色针状结晶，易溶于苯和氯仿，m.p.155～157 ℃。1H-NMR(CDCl3)δ0.64(3H，s，H-18)，δ0.83(3H，d，J=6.9，H-27)，δ0.86(3H，d，J=6.9，H-28)，δ0.94(3H，d，J=6.6，H-25)，δ0.95(3H，s，H-19)，δ1.06(3H，d，J=6.4，H-21)为6个甲基氢信号，δ5.59(1H，s，H-6)，δ5.38(1H，s，H-7)， δ5.23(1H，dd，J=6.7，14.7，H-22)，δ5.22(1H，dd，J=7.5,15.2，H-23)为4个双建的烯氢信号，δ 3.68(1H，m，H-3)为连氧碳上的氢信号；13C-NMR(400 MHz，CDCl3)δ38.37(C-1)，31.99(C-2)，70.47(C-3)，40.79(C-4)，139.80(C-5)，119.59(C-6)，116.28(C-7)，141.42(C-8)，46.23(C-9)，37.02(C-10)，21.12(C-11)，40.48(C-12)，42.82(C-13)，55.56(C-14)，23.01(C-15)，28.33(C-16)，55.69(C-17)，12.07(C-18)，17.63(C-19)，39.07(C-20)，21.12(C-21)，135.58(C-22)，131.96(C-23)，42.80(C-24)，33.09(C-25)，19.67(C-26)，19.99(C-27)，16.30(C-28)。以上数据与文献对照基本一致，故确定该化合物为麦角甾醇[7]。

3 结论

试验对杜仲内生真菌ER12的发酵物进行了化学成分研究，从杜仲内生真菌ER12发酵物乙酸乙酯萃取部分共分离得到4个化合物，经鉴定分别为正丁基-β-D-吡喃果糖苷、甘露醇、啤酒甾醇和麦角甾醇。

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[6] 刘玉红，徐凌川，王建平，等.茶藨子叶孔菌化学成分的研究[J].中药材，2005，28(11)：998-999.

[7] 吕子明，姜永涛，吴立军，等.人工蛹虫草子实体化学成分研究[J].中国中药杂志，2008，33(24)：2914-2917.