基因组编辑技术研究进展

吴璐 王磊 任远 原辉

（深圳华大基因研究院，深圳 518083）

基因组编辑技术研究进展

吴璐 王磊 任远 原辉

（深圳华大基因研究院，深圳 518083）

利用基因组编辑技术可以对生物基因组特定位点进行人工修饰，研究相关基因的功能，进而应用于基础研究和临床治疗方面。序列特异性的DNA结合结构域与非特异性的DNA修饰结构域组合而成的人工酶是基因组编辑工具的重要组成部分。主要介绍了锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）、归巢核酸内切酶（Meganucleases）和成簇间隔短回文重复（CRISPR）4种基因组编辑技术的特点、原理、构建方法及应用，为相关的研究和应用提供参考。

基因编辑 ZFNs TALEN CRISPR 同源重组

基因组定点编辑技术，可以实现对一个或多个目的基因的敲除，或是把外源基因敲入到指定位点，也可以利用转录因子在转录水平上对目的基因的表达水平进行调控，这项技术是研究基因功能并对基因的功能加以利用的最有效手段。

基因组定点编辑工具主要有锌指核酸酶（Zincfinger nucleases，ZFNs）、转录激活样效应因子核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALEN）、归巢核酸内切酶（Meganucleases）和成簇间隔短回文重复（The type II clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR），以上工具均可以对基因组进行精确的定点修饰，工作原理基于核酸内切酶在基因组的特定位点进行切割，从而形成DNA双链断裂（Double strand break，DSB）。细胞中存在天然的DNA损伤应答机制，DSB会被同源重组

修复（Homology directed recombination repair，HDR）和非同源末端连接（Non-homologous end joining，NHEJ）两种方式修复。在同源序列（外源引入或同源染色体）存在的情况下，同源重组修复（HDR）可实现外源基因的插入或基因的靶向修复；在没有同源序列的情况下，细胞趋向于利用非同源的末端连接（NHEJ）进行DNA的修复，它可能引入或删除一个或多个碱基从而造成基因移码突变，使相关基因被敲除。4种基因组编辑技术的序列靶向识别、人工构建方法等均有很大不同。

1 锌指核酸酶（ZFNs）

ZFN是一种人工改造的核酸内切酶，它由特异性的DNA结合结构域和非特异性的切割域两部分构成，其中结合域由一系列串联的具有Cys2-His2结构的锌指蛋白构成，切割域主要是指核酸内切酶

Fok I。在基因组靶标位点左右两边各设计一个ZFN（分别根据正负链的序列），识别结构域将两个ZFN结合到基因组特定位点，当两个识别位点的间距为6-8 bp时，两个Fok I单体相互作用形成二聚体，行使酶切功能对靶标位点进行切割，从而实现基因修饰的目的［1，2］（图1）。

锌指蛋白源自转录调控因子家族，在真核生物中广泛存在，其骨架结构保守，每个锌指蛋白能够识别特定3 bp长的DNA序列，早期的研究中多采用左右两边各3个锌指蛋白来识别总共18 bp的序列（3×3×2），也有的构建方法增加锌指蛋白数目到左右两边各6个，从而增强识别特异性［3］（图1）。

图1 ZFN作用原理示意图

ZFN的构建方法主要有3种：直接组装法、筛选法和商业定制法。直接组装法基于锌指蛋白和碱基间的识别对应关系，直接按照目的序列选择锌指进行组装，这个方法简单易行，但识别效率较低，目前经典的方法主要有MA法（Modular assembly）和CoMA法（Context-dependent assembly）［4-6］。筛选法的思想是采用一步或多步的筛选策略，以OPEN法（Oligomerized pool engineering）为代表，首先构建一个待筛选的锌指库，而后筛选出特异性高的锌指进行下一步的组装，工作量较大，但是效率较高［7］。Sangamo公司成功对ZFN技术进行了商业推广，直接从该公司订购的ZFN表达载体可保证打靶的质量和效率。

2 转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）

TALEN是人工改造的核酸内切酶，也是由特异性的结合域和非特异性的切割域共两部分构成，其中切割域和锌指核酸酶的切割域类似，均为Fok I内切酶；TALEN 的结合域是经过人工改造的TALE蛋白，这种蛋白最初来源于一种植物病原菌——黄单胞杆菌（Xanthomonas）。与锌指核酸酶类似，也是根据靶标位点两侧的序列设计一对TALEN，结合到对应的识别位点后，两个Fok I单体相互作用形成二聚体，对靶标序列进行切割，实现基因修饰的目的［8］。

TALEN系统中，除去N端和C端序列的中间区域包含一系列的长度为34个氨基酸的重复单元（Monomers），该重复单元为TALEN系统识别和结合的基本单位。自然界发现的TALE蛋白包含的monomers个数从1.5到33.5不等，每个monomer的序列高度保守，但是在第12位和13位的两个氨基酸是可变的，称之为RVD（Repeat variable diresidues）［9］。研究发现了RVD和其所识别碱基的一一对应关系，其中NI识别A，HD识别C，NG识别T，NN识别G或是A（图2）。不同的monomers和不同的排列顺序即可决定识别不同的DNA序列。在植物基因组中，原始的TALE识别序列一般从T开始，推测是由TALE的N端序列来识别的。此外，TALEN的结合域一般以半个monomers的重复结束。因此，TALEN识别的DNA序列包含首端的一个T碱基、中间的多个RVDs识别的碱基、末端半个monomers识别的一个碱基。另外TALE识别DNA序列具有方向性，从DNA的5'到3'［10］。

图2 TALEN结构示意图

由于TALEN中存在多个重复序列，所以通过传统分子克隆和人工合成等方法并不能进行有效地组装。目前已开发出了多种方便快捷的组装方法，如Golden-Gate组装、顺序组装和高通量固相组装。应用最广泛的是Golden-Gate组装方法，它的核心策略是采用ⅡS型限制性内切酶和T4连接酶同时进行酶切和连接。ⅡS型内切酶的特点是切割位点位于识别位点之外，例如，Bsa I识别位点为GGTCTC，而

切割模式则是GGTCTCN^NNNN。在酶切连接的过程，每个片段两端均设计上ⅡS型酶的识别序列来产生需要的粘性末端，在连接酶的作用下与含有互补粘性末端的片段连接，达到片段延伸的效果，而ⅡS型内切酶的识别位点则在酶切过程中被消除。优化的Golden Gate组装便捷度更是得到提升，可在1 d内完成组装［11，12］。顺序组装的方法在一定程度上借鉴合成生物学的Bio-Brick的思想，即利用限制性内切酶处理后将每个模块一步一步连接而成［13］。尽管这种方法大大简化了TALEN的构建，但仍需要一定的时间和工作量投入，这造成无法批量生产TALEN，而FLASH技术则可以实现批量化生产。FLASH主要采用固相策略来对TALE的单元片段进行连接，按照所需的monomers的连接顺序，重复性地进行片段连接和洗涤，最终的连接产物则通过限制性消化而从固相中释放出来，而后通过亚克隆连接到表达载体上，完成TALEN的构建［14］。

在人、小鼠、斑马鱼、大鼠、猪等动物和拟南芥、水稻、烟草等植物［10，13，15-18］中成功验证了TALEN对基因组进行编辑的有效性，在这些研究中实现了目的基因的敲除、外源基因的定点插入、基因组大片段删除（利用两对TALEN）和基因的转录调控（用转录因子替代FokⅠ内切酶）［19］。2014年中国科学家成功利用TALEN技术对食蟹猴进行了基因敲除，这是利用这项技术构建出的首个非人类灵长类动物模型［20］。

在疾病治疗方面，报道了利用TALEN技术对诱导多能干细胞（iPS）的突变基因进行了人工修复，也有研究证明这项技术可应用于线粒体基因突变的修复工作，这些研究都为TALEN的临床应用奠定了基础［21］。Y染色体结构的特殊性使得对Y染色体的研究相对滞后，TALEN技术成功地实现了对小鼠Y染色体的基因修饰，可作为研究哺乳动物Y染色体的有效工具［22］。TALEN技术也可以用来研究miRNA，敲除目标miRNA在染色体上的对应序列，从而研究其生物学功能［23］。

3 归巢核酸内切酶

归巢核酸内切酶也是一种工程化的内切酶，它可识别的位点序列较长，从12 bp到40 bp不等。应用最广泛的是LAGLIDADG家族，它广泛地存在于真核生物的线粒体和叶绿体中，常见的有I-SceI、I-CreI和I-DmoI，其家族成员在结构上具有一定的保守性，均包含DNA结合结构域和酶切活性结构域［24］。这项技术早在1990年就被应用于基因修饰，天然存在的归巢核酸内切酶具有高特异性和低细胞毒性的特点，局限性在于已知的归巢核酸内切酶的种类有限，识别的DNA序列也有限。工程化的归巢核酸内切酶是利用生物技术的手段，通过在天然存在的归巢核酸内切酶上引入一定数量的其他氨基酸序列，或是将不同的识别结构域进行融合，从而实现识别DNA序列的目的［25］。目前归巢核酸内切酶技术的研发和应用主要集中在某些较大的生物公司，如Cellestis和Bayer Crop Science。研究表明工程化归巢核酸内切酶可应用于玉米基因组的修饰［26］。在基因治疗方面，有成功应用于修复着色性干皮病的报道［27］。

4 成簇间隔短回文重复（CRISPR）

CRISPR是一种RNA诱导的获得性免疫系统，发现于细菌和古生菌中，用来抵抗外来病毒或是质粒的入侵。该系统由成簇间隔的短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences） 和Cas基 因（CRISPR-associated genes）组成。CRISPR/Cas系统首先产生与靶标序列对应的RNA序列，与病毒或质粒的DNA进行互补作用，然后引导Cas内切酶对互补的序列进行双链切割［28］。其中Cas基因家族中的Cas9广泛地应用于该系统中，它是一种天然存在的内切酶，具有两个酶切活性结构域：HNH核酸酶结构域和Ruv-C-like结构域，分别切割互补链和非互补链。切割过程需要另外两个RNA的帮助，分别为CRISPR RNA（crRNA）和反式CRISPR RNA（trans -acting CRISPR RNA，tracrRNA），人们已经将这两种RNA改造融合成一个向导RNA（single-guide RNA，sgRNA），单个sgRNA足以帮助Cas9实现定点切割的效果［29］（图3）。

经过人工改造的CRISPR/Cas系统一般分为两种，一种主要由Cas9、tracrRNA和crRNA三部分构成；另一种主要由Cas9和sgRNA两部分构成。载

体的构建过程简便快捷，仅需人工合成一段和靶标序列相同的序列，连接至载体特定位点即可，具有高通量高效率的特点［30］。

图3 人工改造CRISPR/Cas9系统作用原理示意图

2013 年，Science等杂志报道了CRISPR技术的开发和应用，该技术迅速成为分子生物学研究热点［29，30］。接下来的研究集中在CRISPR技术在不同的生物中的应用，在大肠杆菌、酵母、水稻、拟南芥、烟草、斑马鱼、人、小鼠和猪等生物中都成功验证了这项技术的功能性，涵盖单基因敲除、外源基因插入、基因靶向修复、多基因敲除、大片段敲除和调控基因表达等［30-39］。南京大学模式动物研究所利用CIRSPR技术对食蟹猴基因组进行了修饰，这是人类首次将基因编辑技术应用在灵长类动物中，这对人类遗传性疾病的基因治疗具有里程碑式的意义［40］。

CRISPR/Cas载体的构建具有高通量高效率的特点。英国洛桑研究所构建了小鼠基因组导向RNAs文库，可靶向基因组中的绝大多数基因［41］。两个实验室构建了针对人类基因组的sgRNA文库，sgRNAs数量分别为73 000和64 751，实现了基因组编辑技术在人全基因水平上的应用［42，43］。

CRISPR/Cas技术的局限性在于存在一定的脱靶现象。多个实验室首先报道了CRISPR系统的脱靶现象，sgRNA与DNA互补配对时，在某些位置上允许1个或两个的碱基不配对，甚至会存在5个碱基不配对的情况［44-46］。这在一定程度上打击了科学家们将CRISPR技术应用于医疗临床的积极性。CRISPR技术最初的开发者张峰带领的实验室利用一对sgRNA来识别靶标位点，大大降低了脱靶效率［47］。南京大学黄兴许课题组也是利用Cas9切口酶和成对sgRNA大大降低CRISPR系统的脱靶效应［48］。

5 总结及展望

以上介绍的基因编辑技术都是采用内切酶在DNA上打开缺口，然后利用细胞内自有的修复机制来实现基因编辑，但每种基因编辑工具都各有特点，总结归类如表1所示。

表1 不同基因组编辑技术比较

有效地提高特异性、减少脱靶率是基因组编辑技术应用于临床治疗的最核心问题，可利用生物信息学的方法尽量选择在基因组上无同源或相似性序列的位点，以减少脱靶效率。需要指出的是，不同基因组编辑技术对不同序列的识别效率存在一定

的差异，原因可能与染色体的结构和不同技术的识别机制有关，例如，在TALEN系统识别切割过程中，染色体的状态可能会影响两个TALE间的距离，从而影响了左右两个Fok I形成二聚体的效率，在CRISPR识别过程中，高G+C含量可能会使gRNA与DNA互补配对更稳定，从而提高切割效率。

对基因组编辑技术的优化改造是当下研究的热点，对于ZFN、TALEN和CRISPR三种技术来讲，一部分研究集中在优化保守性切割域：Fok I和Cas9。利用优化后的Fok I、TALEN元件的C端和N端以及TALE和Fok I的linker，可提高打靶效率［15］。对于来源于S. spyogenes的Cas9，目前已经有其突变型D10A用于产生单链缺口而不是双链断裂［47］。对于Cas9的另一个问题是其编码序列较大，后续研究有望进一步简化Cas9序列或是找出其同源的内切酶，以期提高转染效率和切割特异性。

基因编辑工具对于基础研究和临床应用均有重大意义。早期经典的突变技术及同源重组技术为反向遗传学的研究做出了重大贡献，新一轮的ZFN、TALEN、CRISPR等技术使基因敲除和插入技术变得更为简便快捷，这对研究基因功能非常重要。在疾病模型方面，很多单基因疾病的研究尚未建立小鼠疾病模型，利用基因编辑技术在小鼠胚胎干细胞中进行单基因敲除，进而得到基因敲除小鼠，这对研究单基因疾病非常重要，是进行病理学研究和药物筛选的基础；在动植物育种方面，利用基因敲除技术可以得到某特定基因敲除的动植物，获得特定的性状。例如，敲除myostain基因后可获得肌肉量增多的牛品种［49］。也可利用基因插入技术获得转基因动物，如乳腺反应器，将某些药物蛋白敲入到牛或羊的β-catenin启动子下，得到可在乳汁中分泌药物蛋白的动物个体；在疾病治疗方面，利用基因编辑技术对疾病相关的基因突变进行靶向修复，进而达到基因治疗的目的。总之对于基因的研究离不开基因组编辑技术，基因组编辑技术的不断更新发展是必然的趋势。

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（责任编辑 李楠）

The Research of Genome Editing

Wu Lu Wang Lei Ren Yuan Yuan Hui
（BGI-Shenzhen，Shenzhen 518083）

Genome Editing can be used to operate artificially almost any gene in cells or organisms. This research method of gene function is useful for fundamental research and clinic treatment. The major component of this tool is artificial nuclease with specific DNA-binding domain and non-specific DNA-modifying domain. This article reviews the characteristics, principle, construction and application of ZFN, TALEN and CRISPR/Cas, which would be useful reference for related research.

Gene editing ZFNs TALEN CRISPR Homologous recombination

2014-01-26

深圳市战略新兴产业发展专项资金项目（CXZZ20120615141322654）

吴璐，女，硕士，研究方向：分子生物学；E-mail：wulu@genomics.cn

原辉，男，博士，研究方向：动植物分子育种；E-mail：yuanhui@ genomics.cn