马铃薯AGPase活力反馈调控光合速率定量分析

白桦崔雪琼白少星姚新灵

（1.宁夏农业学校，银川 750021；2.郑州第二人民医院，郑州 450063；3.宁夏大学生命科学学院，银川 750021）

马铃薯AGPase活力反馈调控光合速率定量分析

白桦1崔雪琼2白少星3姚新灵3

（1.宁夏农业学校，银川 750021；2.郑州第二人民医院，郑州 450063；3.宁夏大学生命科学学院，银川 750021）

为了揭示ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）改变对叶片光合作用的反馈调控，以改变AGPase活力的马铃薯转化株系为材料，测定了其AGPase活力（AA）、块茎淀粉积累量（SC）、叶片光合速率（PR）、叶绿素（CC）和蔗糖含量（SUC）等；测定结果分析显示，各株系的AGPase活力（AA）、块茎淀粉积累量（SC）和叶片光合速率（PR）间存在显著差异，且均显著高于对照；株系间AGPase活力、块茎淀粉含量和叶片光合速率呈显著正相关性；每单位AGPase活力上升可贡献贮藏器官淀粉积累增加2.5%，且是影响叶片光合速率的重要因素；结果表明，AGPase不仅是下游淀粉积累的限速酶，而且可向上游反馈调控光合速率。

淀粉含量 光合速率 ADP-葡萄糖焦磷酸化酶 相关性

尽管合成途径中的代谢物通过异构和氧化还原等途径调控淀粉积累，但就从碳固定到淀粉积累过程中对淀粉生物合成调控的理解则十分有限［1］。转录组表达谱分析表明，营养缺乏条件下，淀粉生物合成相关基因上调表达，而淀粉消耗及光合作用途径基因则下调表达［2］。

营养胁迫使植物更倾向于光合产物用于淀粉积累，在联系光合产物与淀粉积累间的代谢途径中，昼夜周期通过Rubisco介导的CO2的固定调控光合作用，还调控着叶片转运淀粉的降解速度，确保夜间生长对碳的需求［3］。在途径下游，腺苷二磷酸葡萄糖焦化酶（AGPase）也受到昼夜周期调控［4］。

AGPase以磷酸葡萄糖为底物，代谢合成腺苷二磷酸葡萄糖（ADP-葡萄糖），后者是淀粉生物合成的底物；在细菌和植物中AGPase分别是糖原和淀粉生物合成的限速酶，植物AGPase是由大亚基和小亚基组成的异源四聚体；叶片中AGPase不同isoform受到长短日照的光周期调控，呈现分化表达［5］。

大肠杆菌不同菌株中glgC的突变，可显著改变其编码AGPase的活力，表达glgC的马铃薯，其块茎淀粉含量提高30%以上［6］；植物中过量表达具有催化代谢功能的AGPase小亚基编码基因，可显著提高AGPase活力，增加贮藏器官及其它组织的淀粉积累［7-9］。

在光合与淀粉积累间的代谢途径中，AGPase通过其活力改变，调控其下游淀粉的积累；AGPase催化的底物磷酸葡萄糖来自光合作用，尽管已明确AGPase小亚基cysteine 81是介导昼夜周期调控、形成二聚体所必需的［10］，但AGPase对途径上游、尤其是如何影响光合作用尚属未知。

1 材料与方法

1.1 材料

前期研究完成了由大肠杆菌glgC、马铃薯淀粉粒结合淀粉合成酶基因和AGPase小亚基基因组成的重组基因构建及转化，获得表达了不同目的基因的8个株系，2株SG株系（株系SG1、SG2）表达了单拷贝大肠杆菌glgC（编码AGPase），2株AG株系（株系AG1、AG2）表达单拷贝glgC和马铃薯AGPase小亚基基因（SS）反义cDNA，4株GG（株系GG1-4）表达单拷贝glgC和马铃薯淀粉粒结合淀粉合成酶基因（GBSSI）反义cDNA株系；本研究以此8个株系和其宿主紫花白对照为材料进行其后的测定及分析。

实验室条件下繁殖各株系试管苗，待试管苗生长至8 cm，移栽于盛有品氏托普基质的营养钵内，每2 d浇水1次，在温度25℃，光照强度12 kLx、15 h光照下培养到15 d后，移至同样光照强度8 h光照下培养诱导结薯，诱导培养15 d后，随即分别在各株系个体上、中、下3个部分采集生长良好、大小一致的叶片1 g，用于叶绿素含量、蔗糖含量和ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活力测定，样品随采随用。第30天收获块茎，风干3 d后储藏于4℃用于块茎淀粉含量测定。

1.2 方法

光照诱导培养15 d后，采用英国产CIRAS-Ⅰ型便携式光合测量仪测定净光合速率（以下简称光合速率），测定操作步骤按照说明书进行；上午10时，在每个个体上、中、下3个部位，选择大小相似、充分伸展的8个叶片，取均值为单次测定结果，间隔1 d测定第2次，同前测定计算的数据为第2次重复，测定共重复3次。

按照Wickliff等［11］的方法进行叶绿素含量（w/w，%），蔗糖含量（w/w，‰）用蔗糖含量测定试 剂 盒（Glucose and Sucrose Assay Kit、ab65334，ab-cam，USA）进行。采用淀粉测定试剂盒（EnzyChromTMStarch Assay Kit BioAssay Systems，USA）完成块茎淀粉含量测定。块茎ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活力测定按照姚新灵等［12］的方法进行。

为了便于直观比较分析，SG、AG和GG株系3个群体各个体叶绿素含量、光合速率和蔗糖含量除以群体中的最大均值后，以得到的商为统计变量进行统计分析；群体各个体块茎淀粉含量减去对照株系块茎淀粉含量所得所得差作为块茎淀粉含量统计变量进行统计分析。

2 结果

2.1 AGPase活力、块茎淀粉含量和光合速率差异显著

面对迅猛的城市化浪潮，新一轮针对城市发展的研究和实践将迎来热潮。古希腊哲学家赫拉克利特曾经说过：“看不见的和谐比看得见的和谐更美。”以文化营销的方式，为城市的发展注入新的可持续发展动力。通过充分挖掘城市文化资源、有效将文化资源转变为文化资产、增强城市文化认同、提升城市治理能力等途径，以打造城市多元文化景观空间、寻求城市准确清晰定位、运用“文化+”、进行多产业融合、巧用新媒介平台拓宽城市宣传渠道等方式，不仅可以完善城市文化营销的理论，也能更好地推动城市的良性发展，具有较强的实用性和前瞻性。

8个转化株系AGPase活力、块茎淀粉含量、叶片叶绿素、叶片蔗糖含量和叶片光合速率测定结果分析显示，8个株系块茎淀粉含量、AGPase活力、叶片光合速率间及块茎淀粉含量间存在显著差异（P ＜0.05），且极显著高于对照株系（P＜0.01）（图1-图3）；叶片叶绿素和蔗糖含量在各株系间存在不显著差异（P ＜0.05）（图4）。

2.2 AGPase活力、块茎淀粉含量和光合速率的相关性

2.2.1 AGPase活力与块茎淀粉含量呈正相关性 转化株系块茎AGPase活力间、块茎淀粉含量间及叶片光合速率间差异显著，且显著高于对照。为了明确三者联系，相关分析显示，尽管AGPase活力与叶片光合速率无显著相关性，但光合速率与块茎淀

粉含量间相关系数为0.651，呈显著Pearson相关性（P ＜0.05）。

图1 株系块茎淀粉含量比较

图2 株系AGPase活力比较

图3 株系叶片光合速率比较

转化株系间块茎淀粉含量和AGPase活力相关分析显示，两指标相关系数为0.875，呈显著Pearson相关性（P＜0.01）；块茎淀粉含量和AGPase活力回归模型方差分析显示，回归模型显著（P＜0.01），回归系数为2.47；t检验显示其统计显著（P＜0.01），常数为5.45；所以块茎淀粉含量（SC）和AGPase活力（AA）一元线性方程为：SC = 2.47AA + 5.45（图5）。

图4 株系叶绿素及叶片蔗糖含量比较

图5 块茎淀粉含量（SC）和AGPase活力（AA）线性方程

2.2.2 块茎淀粉含量与光合速率呈正相关性 光合速率与块茎淀粉含量回归模型方差分析显示，回归模型显著（P＜0.05），回归系数为0.22；t检验显示其统计显著（P＜0.05），常数为0.55；所以光合速率（PR）与块茎淀粉含量（SC）一元线性方程为：PR=0.22 SC+0.55（图6）。

2.2.3 AGPase活力与与光合速率呈正相关性 AGPase活力与光合速率回归模型方差分析显示，回归模型显著（P＜0.05），回归系数为0.42；t检验显示其统计显著（P＜0.05），常数为2.382；所以，光合速率（PR）与块茎淀粉含量（SC）一元线性方程为：PR = 0.42AA + 2.38（图7）。

2.3 AGPase活力、块茎淀粉含量和光合速率相关性比较

以各回归显著的3个指标AGPase活力、光合

速率、块茎淀粉含量的回归系数的倒数表示其各自的相关程度的直观结果如图8所示，其中数字越小表示两者越接近，相关程度越高；AGPase与光合作用的相关程度远不及其与淀粉积累，但光合作用与AGPase的相关程度远高于光合作用与淀粉积累的相关程度。

图6 光合速率（PR）与块茎淀粉含量（SC）线性方程

图7 AGPase活力（AA）与光合速率（PR）线性方程

图8 回归系数倒数表示的相关程度结果的直观示意图

3 讨论

各株系AGPase活力、块茎淀粉含量、叶片光合速率间及块茎淀粉含量间存在显著差异，且极显著高于对照株系，这一结果表明，大肠杆菌glgC重组基因体内表达，提高了AGPase活力，增加了转化株系块茎淀粉积累，这与以往研究报道的结果一致［7］，AGPase活力提高增加了ADP葡萄糖的合成，高水平淀粉合成底物—ADP葡萄糖增强了淀粉积累。

块茎淀粉含量（SC）和AGPase活力（AA）一元线性方程（SC = 2.47AA + 5.45）的结果表明，AGPase活力每增加1单位，可使块茎淀粉含量提高2.5%；尽管以往就植物淀粉积累依赖于AGPase活力的定性报道诸多［7］，但尚未见块茎淀粉含量在多大程度上依赖于AGPase活力的定量报道，本研究所得出比率属首次提出。

光合速率受到内外多种因素影响，本研究光合速率与块茎淀粉含量显著正相关的结果表明，贮藏器官淀粉积累的增加可反馈调控光合速率提高，在本试验条件下，回归系数为0.22的结果意味着影响光合速率提高的2%来自贮藏器官淀粉积累的增加。

AGPase与光合作用的相关程度远不及其与淀粉积累，而光合作用与AGPase的相关程度远高于光合作用与淀粉积累的相关程度，这一结果表明AGPase活力的改变不仅直接调控其下游淀粉的积累，而且向上游通过反馈调控光合作用间接调控淀粉积累，近年研究证据也支撑了AGPase反馈调控光合作用。

光合电子传递链产生的氧化还原信号，参与卡尔文循环、ATP合成及NADPH从叶绿体输出［13］，抑制电子传递链中硫氧还蛋白（Trx f1）表达，导致光激活的还原态AGPase活力衰减，淀粉合成随之下降［14］，AGPase与磷酸丙糖相关功能缺失的双突变体（adg1-1/tpt-2），在高光强下碳水化合物合成减少［15］；因此，AGPase通过光合电子传递反向影响光合作用。

叶绿素含量和蔗糖含量并未随贮藏器官淀粉积累的增加而改变，同时也未受光合速率的影响，这一结果表明，光合速率提高并未改变叶片叶绿素含量和蔗糖含量相关的代谢平衡。结果同时也表明，AGPase活力改变并未通过叶绿素含量和蔗糖含量反馈调控光合作用，而是通过其它目前尚不明确的途径调控光合作用，这有待进一步研究。

4 结论

（1）AGPase不仅是下游淀粉积累的限速酶，而且可向上游反馈调控光合速率。（2）AGPase对光合作用的反馈调控关键节点有待进一步研究。

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（责任编辑 李楠）

Quantitative Analysis on Feedback of AGPase to Photosynetic Rate in Potato

Bai Hua1Cui Xueqiong2Bai Shaoxing3Yao Xinling3
（1. Ningxia Agriculture School，Yinchuan 750021；2. Zhengzhou 2ndRenmin Hospital，Zhengzhou 450063；3. Life Science School，Ningxia University，Yinchuan 750021）

To reveal feedback regulation of ADP-pyrophosphrolase（AGPase）to photosynthesis, AGPase activities（AA）, starch contents（SC）in tuber, photosynthetic rates（PR）, chlorophyll contents（CC）and sucrose contents（SUC）in leafs were assayed with potato transgenic lines showing difference on ADP-pyrophosphrolase activities. The data analysis showed that AA, SC and PR in transgenic lines were significantly higher than control line. Significantly differences were found between AA, SC and PR among the lines. Correlation analysis showed that there were positive correlations between AA, SC and PR. Per unit rising of AGPase activities can contributed 2.5% increase of starch contents in sink tissue. AGPase was a factor playing a role in regulation of photosynthetic rates. The result indicated that AGPase not only regulates starch accomulation on the downstream, also feedback to modulate photosynthetic rate.

Starch contents Photosynthetic rate ADP-pyrophosphrolase Correlation

2014-04-09

国家自然科学基金项目（30660079），2012年宁夏科技支撑计划

白桦，女，副教授，研究方向：植物生理学；E-mail：1486814368@qq.com

姚新灵，博士，教授，研究方向：植物分子生物学；E-mail：chinanoahl@163.com