姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响

袁琦 张征 胡小宣

湖南省人民医院肝病内科，湖南长沙 410005

姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响

袁琦 张征 胡小宣

湖南省人民医院肝病内科，湖南长沙 410005

目的研究姜黄素体外对人结肠癌Lovo细胞血管内皮生长因子VEGF表达的影响。方法不同浓度(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L)姜黄素处理2013年8月—2014年2月中南大学提供的人结肠癌细胞株Lovo24 h后，用Real-time PCR检测姜黄素对人结肠癌细胞株血管内皮生长因子VEGF mRNA表达的变化，用Western blot法检测姜黄素对人结肠癌细胞株VEGF蛋白表达的变化。 结果人结肠癌Lovo细胞经过姜黄素处理24 h后，5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L姜黄素组VEGF mRNA及蛋白的表达均明显下降，与对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 姜黄素能下调人结肠癌Lovo细胞VEGF的表达，并呈剂量依赖，这可能是姜黄素抑制结肠癌Lovo细胞增殖及侵袭性的机制之一。

姜黄素；结肠癌；血管内皮生长因子

姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然有效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理作用，且毒性低，具有良好的临床应用潜力，尤其是其抗肿瘤作用受到国内外广泛关注。结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，虽然近年来以手术、化疗、放疗、免疫等的综合治疗手段取得了一定的进展，但其死亡率仍居高不下，毒性作用依然限制着化疗药物和免疫制剂等的应用和疗效。有研究表明，姜黄素能显著抑制结肠癌HCT-116细胞的生长[1]，姜黄素能显著抑制人结肠癌Lovo细胞的增殖并促进其凋亡[2]，研究证实在肿瘤的侵袭、转移过程中，血管内皮生长因子（VEGF）起到了极其重要的作用[3]。该实验以2013年8月—2014年2月中南大学提供的结肠癌Lovo细胞作为研究对象，观察了不同浓度姜黄素对结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响，以求从多角度对姜黄素对结肠癌细胞的作用进行研究，对结肠癌临床治疗提供有益的理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

人结肠癌Lovo细胞由中南大学肿瘤研究所提供；姜黄素购自Sigma公司，称取3.684 mg的原料药充分溶解于1 mL DMSO中，得到终浓度为10 mmol/L的母液，临用时用完全细胞培养液稀释到所需浓度。Trizol、逆转录试剂盒购自大连宝生物公司，引物由大连宝生物公司合成。蛋白提取液及ECL发光试剂盒购自Pierce公司，兔抗人VEGF多克隆抗体及羊抗兔二抗lgG购自Santa Cruz公司。

1.2 细胞的培养及处理

人结肠癌Lovo细胞接种于含10%胎牛血清1640培养基，置于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的Lovo细胞，实验分组为对照组（姜黄素0 μmol/L，加入等量DMSO），姜黄素5 μmol/L，10 μmol/L，20 μmol/L，40 μmol/L组，处理后再置于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24 h。

1.3 Real-time PCR

采用Trizo1试剂一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，计算OD260/280，比值在1.8～2.0的RNA标本用于反转录。总RNA按说明书进行逆转录反应合成cDNA，逆转录产物cDNA用于Real-time-PCR扩增。VEGF引物：5'端: 5'-GGGGGATCCGCCTCCGAA-ACCATGAACTT-3'及3'端:5'-CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGA-TCTGGTT-3'，变性、退火温度为94℃与72℃，40个循环。利用标准曲线，根据样品CT值计算出样品中所含的模板量。

1.4 Western Blot

用蛋白提取液提取细胞蛋白，BCA测总蛋白质浓度。蛋白样品用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，上样量为20 μg。5%脱脂奶粉TBS缓冲液封闭，4℃过夜，加兔抗人VEGF多克隆抗体(1：500)室温2 h，洗膜30 min，加入羊抗兔二抗(1：1000)室温结合 1 h，ECL显色，内参采用 β-actin。采用 Image-Pro Plus6.0图像分析软件对蛋白条带进行灰度分析。以VEGF条带与内参β-actin条带的灰度比值代表VEGF蛋白的表达水平。

1.5 统计方法

2 结果

2.1 不同剂量姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF mRNA表达的影响

利用Primer 3.0软件分别设计出扩增人VEGF和GAPDH mRNA的引物，Real-time PCR检测VEGF mRNA的表达，见表1，并用EXCEL做出各组VEGF mRNA相对表达量柱状图表达，见图1，姜黄素5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L组与对照组相比，VEGF mRNA的表达均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），且呈剂量依赖性。

表1 姜黄素处理后，Lovo细胞VEGF mRNA和蛋白的相对表达（）

表1 姜黄素处理后，Lovo细胞VEGF mRNA和蛋白的相对表达（）

注：n=3，与对照组比较*P＜0.05。

组别VEGF mRNA表达（VEGF/GAPDH）VEGF蛋白表达（VEGF/β-actin）Control姜黄素5 μmol/L姜黄素10 μmol/L姜黄素20 μmol/L姜黄素40 μmol/L 0.422±0.015（0.253±0.016）*（0.198±0.009）*（0.166±0.011）*（0.116±0.009）* 0.0730±0.0042（0.0487±0.0030）*（0.0406±0.0048）*（0.0322±0.0057）*（0.0287±0.0025）*

2.2 不同剂量姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF蛋白表达的影响

不同剂量姜黄素处理Lovo细胞，收集细胞总蛋白，用Western Blot检测VEGF蛋白的表达（结果见图2），并用Image-Pro Plus6.0对图像进行灰度分析（结果见表1，图3），姜黄素5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L组与对照组相比VEGF蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），且呈剂量依赖性。

图1 检测姜黄素处理Lovo细胞VEGF mRNA的表达

图2 检测姜黄素处理Lovo细胞VEGF蛋白表达

图3 检测姜黄素处理Lovo细胞VEGF蛋白表达灰度比均值（n=3，P＜0.05）

3 讨论

血管内皮生长因子VEGF随着肿瘤增殖、侵袭和转移而表达明显升高[4]。VEGF信号还与肿瘤细胞的淋巴管、淋巴结侵袭及远端转移密切相关[5]。梁启廉等研究发现VEGF表达水平与大肠癌组织学分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移有关[6]。且临床观察发现大肠癌患者术前血清VEGF水平与大肠癌的浸润、转移密切相关[7]。有研究者利用同源重组将结肠肠癌细胞系中VEGF-A敲除后发现，当细胞缺失了VEGF信号后，细胞的生长受到了明显的抑制，且细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶的敏感性增强[8]，而在临床上仅仅通过阻断细胞表面的VEGF受体来治疗结直肠癌效果是有限的。

目前研究发现，姜黄素能够对消化系肿瘤有很好的抑制作用，其药理活性主要表现在能够下调核转录因子（NF-k B）的活性，诱导细胞周期停滞和细胞凋亡，抑制血管生成[9]。在人结肠癌HCT116细胞中，姜黄素可有效抑制结肠腺癌细胞集落生长和侵袭能力[10]。不同浓度姜黄素作用人结肠癌SW620细胞24 h，增殖抑制显著[11]。

该研究用4种不同浓度的姜黄素分别作用Lovo细胞24 h后，利用Real-time PCR及Western Blot方法检测VEGF的mRNA及蛋白的表达，发现各姜黄素组（5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L）与对照组比较，VEGF的mRNA及蛋白的表达明显下降，差异有统计学意义（P＜0.05），且姜黄素的作用浓度越高，VEGF的表达量越低，该作用呈剂量依赖，提示姜黄素能通过抑制人结肠癌细胞Lovo中VEGF的表达来抗结肠癌血管形成，抑制结肠癌细胞的生长和转移。此结果与贾佳等的观点一致，他们发现姜黄素能够下调结肠癌细胞HT-29中 β-catenin、VEGF的表达[12]。在多个结肠癌细胞系中，均有研究证实姜黄素能下调VEGF的表达，进一步可利用建立的结肠癌裸鼠移植瘤模型，从体内水平研究姜黄素能否下调瘤组织VEGF的表达，且姜黄素是否通过NF-KB信通路来下调人结肠癌细胞VEGF的表达，该机制也有待进一步研究。VEGF是抗癌药物治疗的新靶点，姜黄素作用后的人结肠癌Lovo细胞VEGF水平下降，提示姜黄素可能通过下调VEGF的表达抑制了VEGF促进肿瘤新生血管的作用，从而抑制了结肠癌的增殖和转移。该研究为姜黄素的临床应用提供新的理论依据。

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[2]郭立达，焦振霞，宋瑛，等.姜黄素诱导结肠癌LoVo细胞凋亡的作用及机制研究[J].中国中药杂志，2013，38(13):2191-2196.

[3]N Ferrara HPG，LeCouter J.The biology of VEGF and its receptors[J]. Nat Med，2003，9（6）：669-676.

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[12]贾佳，赵逵，张银萍，等.姜黄素对人结肠癌细胞HT-29中β-catenin、血管内皮生长因子的影响[J].中国老年学杂志，2014，24(14)：3940-3942.

Effects of Curcumin on the Expression of VEGF in Human Colon Cancer Lovo Cells

YUAN QiZHANG Zheng HU Xiapxuan
Department of Hepatology,Hunan Provincial People's Hospital,Changsha,Hunan Province,410005,China

Objective To study the effect of curcumin on the expression of VEGF in human colon cancer Lovo cells in vitro. Methods The human colon cancer cell lines Lovo were treated with 0 μmol/L,5 μmol/L10 μmol/L,20 μmol/L,40 μmol/L curcumin for 24 hours respectively,then we detected the human colon cancer cell lines VEGF mRNA expression by Real-time PCR and VEGF protein expression by Western Blot.Results After the human colon cancer cell lines Lovo cells treated with curcumin for 24 hours respectively,the expression of VEGF mRNA and protein of the curcumin-treated groups(5 μmol/L,10 μmol/L,20 μmol/L, 40 μmol/L)had more significant reduction compared with control group (P<0.05).Conclusion Curcumin could decrease the expression of VEGF in human colon cancer Lovo cells dose-dependently,this may provide some evidence for the mechanism that curcumin could inhibit the proliferation and invasion of colon cancer Lovo cells.

Curcumin;Colon cancer;Vascular endothelial growth factor

R587.1

A

1674-0742（2014）12（b）－0035-03

2014-09-16）（

2014-09-16）

袁琦（1983.1-），女，湖南邵东人，医学硕士，医师，研究方向：消化道肿瘤。