安徽省4个地方鸡品种OCX-32基因外显子4的多态性及其与淮南麻黄鸡蛋品质的相关分析

李俊营，詹 凯，毕善辉，刘 伟，韩 涛，李绍全

(1 安徽省农业科学院 畜牧兽医研究所，安徽 合肥 230031；2 安徽农业大学 生命科学学院，安徽 合肥 230036；3 安徽皖西麻黄鸡禽业有限公司，安徽 六安 237400)

蛋品质是禽蛋生产中的一个重要经济性状，良好的蛋壳品质有助于减少因蛋壳破损造成的经济损失。因此，在蛋鸡育种中如何提高蛋品质受到相关研究人员的关注。近年来，随着鸡基因组测序图谱、SNP草图及功能解析的不断完善，利用功能基因组学研究的技术和方法，发掘和利用影响蛋品质候选基因中的有效分子标记，是提高蛋品质的重要途径之一。

Ovocalyxin-32(OCX-32)是一种蛋壳基质蛋白，由输卵管末端上皮细胞分泌到子宫液中，在蛋壳形成的终止阶段其表达量逐渐增加[1-2]，导致碳酸钙沉降的时间逐渐延长[3-4]，可能具有终止钙化的功能[5]。OCX-32由275个氨基酸(AA)组成[6]，主要分布在蛋壳的表层(即角质层)，蛋壳角质层与外界环境中的病原微生物直接接触，是鸡蛋防御外界微生物侵袭的第一道屏障[7-8]，具有抗菌作用。有研究表明，编码OCX-32蛋白的基因对蛋壳品质和产蛋量具有显著影响[9-12]。Dunn等[10]发现，OCX-32基因的一个内含子单核苷酸多态性(SNP)与鸡蛋乳突层厚度显著相关；Uemoto等[11]发现，OCX-32基因与产蛋率显著相关。蛋鸡产蛋性能影响着OCX-32基因的表达，低产蛋性能蛋鸡的OCX-32表达量较高，高产蛋性能蛋鸡反而表达量较低，这表明OCX-32基因是影响产蛋率的一个候选基因[13]。

目前，有关OCX-32基因对蛋鸡生产性能和蛋品质影响的研究相对较少，其在我国地方家禽品种淮南麻黄鸡中的遗传多样性尚未见报道，而且淮南麻黄鸡生产中存在产蛋率低和蛋质量小等问题。本试验研究了安徽省4个地方鸡品种中OCX-32基因外显子4的遗传多态性，并分析了外显子4的多态性与淮南麻黄鸡蛋品质之间的相关性，旨在探寻与淮南麻黄鸡蛋品质密切相关的遗传标记位点，为淮南麻黄鸡的选育提供理论依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

皖南三黄鸡来源于安徽省池州市青阳县畜牧兽医站皖南三黄鸡原种场，样本量为60只；五华鸡来源于安徽省芜湖市繁昌县芜湖钟氏禽业有限公司，样本量为120只；淮北麻鸡来源于安徽省宿州市兴强养禽专业合作社，样本量为60只；淮南麻黄鸡来源于安徽省六安市安徽皖西麻黄鸡禽业有限公司，样本量为308只。其中淮南麻黄鸡于18周龄时转入产蛋舍个体笼饲养，记录开产蛋质量，在30周龄时连续5天测定308只鸡所产鸡蛋的质量、蛋形指数、蛋壳厚度和蛋壳强度等蛋品质指标，参照文献[14]的方法进行蛋品质测定。

1.2 主要试剂

蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL 2000 DNA Marker、琼脂糖、DNA片段回收试剂盒等均购于宝生物工程(大连)有限公司，酚、氯仿等试剂购于上海生工生物工程技术服务有限公司。根据GenBank上公布的OCX-32基因序列(GenBank登录号：NM_204534和AADN02021077.1)，用Primer 5.0软件设计1对引物(上游：5′-TGTTTCTGATGAAGAGCCAGA-3′，下游：5′-CTTTGCCAC-TCTGTAGGCTGT-3′)，用于OCX-32基因第4外显子扩增[11]。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.3 鸡基因组DNA的提取

试验鸡翅静脉采集血样1.5 mL/只，ACD抗凝，低温带回实验室后于-80 ℃保存。采用苯酚/氯仿法提取鸡血液基因组DNA，用TE溶液将DNA样品稀释成50 ng/μL的溶液备用。

1.4 OCX-32基因外显子4的PCR扩增及PCR-NcoⅠ-RFLP酶切

1.4.1 PCR扩增 PCR反应体系总体积为20 μL，其中含有10×PCR buffer(不含Mg2+)2.0 μL，20 mmol/L MgCl21.5 μL，10 mmol/μL 4×dNTPs Mix 0.4 μL，10 pmol/L上下游引物各1.0 μL，5 U/μLTaqDNA 聚合酶0.25 μL和50 ng/μL DNA模板 1.0 μL，加灭菌双蒸水至20 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性40 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，35个循环；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR扩增产物用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4.2 PCR-NcoⅠ-RFLP 酶切体系为：3 μL PCR产物、10 U/L的限制性内切酶NcoⅠ 0.1 μL、10×buffer 1.5 μL，加灭菌双蒸水至15 μL，混匀后于37 ℃恒温水浴锅中酶切过夜，次日用15 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测，Alpha Innotech凝胶成像系统照相分析。根据特征条带类型判定基因型。

1.5 数据统计分析

利用软件POPGEN(Version 1.31)计算基因型频率、等位基因频率、杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)。对数据进行卡方检验，参考文献[15]的方法检验Hardy-Weinberg平衡状态。

考虑到试验鸡群遗传背景一致，饲养管理相同，构建如下一般线性模型：Yijk=μ+Gj+eijk。式中：Yijk表示各个体性状测定值，μ表示群体均值，Gj表示基因型效应，eijk表示随机误差。

2 结果与分析

2.1 OCX-32外显子4的PCR扩增及PCR-NcoⅠ-RFLP酶切分析

OCX-32基因第4外显子在4个地方鸡品种中的扩增产物均为1条250 bp的特异性条带，其中五华鸡的扩增结果见图1。该片段经PCR-NcoⅠ-RFLP检测，发现在494位核苷酸处存在A→C突变，表现为3种基因型(图2)：AA(250 bp)、AC(250 bp+194 bp+56 bp)和CC(194 bp+56 bp)，其中五华鸡的酶切结果见图2。

图1 五华鸡OCX-32基因外显子4的扩增结果

2.2 不同品种鸡OCX-32基因外显子4的遗传多态性分析

4个地方鸡品种OCX-32外显子4的基因型和等位基因频率、杂合度(He)、多态信息含量(PIC)等指标的计算结果见表1。

表1 4个品种鸡OCX-32基因外显子4 A494C位点的遗传多态性分析

由表1可知，在4个地方鸡品种中，AC基因型所占比例均较高，所检测样本群体均处于中度多态；卡方检验结果表明，4个群体在A494C位点都处于Hardy-Weinberg平衡状态。

2.3 OCX-32基因外显子4基因型与淮南麻黄鸡蛋品质的相关性分析

由表2可知，不同基因型对淮南麻黄鸡蛋形指数、蛋壳厚度、蛋壳强度、蛋黄色泽和蛋黄比率均无显著影响(P>0.05)；但对开产蛋质量、30周龄蛋质量、蛋白高度和哈氏单位影响显著(P<0.05)。CC基因型的开产蛋质量和30周龄蛋质量比AA基因型分别高5.93%和2.91%(P<0.05)；AA和CC基因型的蛋白高度比AC基因型分别高5.96%和4.51%(P<0.05)；AA基因型的哈氏单位比AC基因型高2.35%(P<0.05)。

表2 淮南麻黄鸡OCX-32基因外显子4 A494C位点不同基因型与其蛋品质的相关性分析

3 讨 论

OCX-32是壳腺分泌的一种基质蛋白，因具有抗菌和可能终止蛋壳钙化的功能而备受研究人员的关注[16-17]。Takahashi等[18]研究发现，鸡9号染色体上具有影响蛋品质性状的数量性状基因座(QTL)，并建议将OCX-32基因作为影响蛋品质性状的候选基因。OCX-32基因位于鸡9号染色体上，包括6个外显子和5个内含子[6]，外显子1上存在rs16680302和rs16680303 2个突变位点[11]，外显子2-6上发现28个SNPs和1个碱基缺失[19]。本试验发现，OCX-32基因外显子4第494位点存在A→C的突变，安徽省4个地方鸡品种试验群体在A494C位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态，4个地方鸡品种群体均表现为中度多态，遗传多样性都比较丰富。这可能是由于4个家禽品种都是安徽省的地方品种，经过长期的进化与选择，在所处的生态环境条件下，形成了适应环境的遗传特性。

有研究表明，OCX-32基因对鸡蛋的蛋品质(蛋壳颜色、蛋白高度、蛋质量、蛋黄质量、鸡蛋纵径长度和鸡蛋横径长度等)[9,19]和产蛋率[11]有显著影响。本试验表明，OCX-32基因外显子4的A494C位点基因多态性与淮南麻黄鸡开产蛋质量、30周龄蛋质量、蛋白高度和哈氏单位显著相关(P<0.05)。CC基因型的开产蛋质量和30周龄蛋质量显著高于AA基因型；AA和CC基因型的蛋白高度显著高于AC基因型；AA基因型的哈氏单位显著高于AC基因型(P<0.05)。针对淮南麻黄鸡生产中蛋质量小的缺点，C等位基因型的选择有利于提高淮南麻黄鸡的蛋质量。但由于试验群体样本量的限制，C等位基因是否可以作为提高蛋质量的有利基因，还有待于进一步研究。

[参考文献]

[1] Miksik I,Eckhardt A,Sedlakova P,et al.Proteins of insoluble matrix of avian (Gallusgallus) eggshell [J].Connect Tissue Res,2007,48(1):1-8.

[2] Hincke M T,Gautron J,Mann K,et al.Purification of ovocalyxin-32, a novel chicken eggshell matrix protein [J].Connect Tissue Res,2003,44(Suppl.1):16-19.

[3] Dominguez-Vera J M,Gautron J,Garcia-Ruiz J,et al.The effe-ct of avian uterine fluid on the growth behavior of calcite crystals [J].Poultry Science,2000,79(6):901-907.

[4] Hernandez-Hernandez A,Gomez-Morales J,Rodriguez-Navarro A B, et al. Identification of some active proteins in the process of hen eggshell formation [J].Cryst Growth Des,2008,8(11):4330-4339.

[5] Gautron J,Hincke M T,Nys Y.Precursor matrix proteins in the uterine fluid change with stages of eggshell formation in hens [J].Connect Tissue Res,1997,36(3):195-210.

[6] Gautron J,Hincke M T,Panheleux M,et al.Ovocalyxin-32,a novel chicken eggshell matrix protein.isolation,amino acid sequencing,cloning,and immunocytochemical localization [J].J Biol Chem,2001,276(42):39243-39252.

[7] Rose-Martel M,Du J,Hincke M T.Proteomic analysis provides new insight into the chicken eggshell cuticle [J].J Proteomics,2012,75(9):2697-2706.

[8] Xing J,Wellman-Labadie O,Gautron J,et al.Recombinant eggshell ovocalyxin-32:Expression,purification and biological activity of the glutathione S-transferase fusion protein [J].Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol,2007,147(2):172-177.

[9] Takahashi H,Sasaki O,Nirasawa K,et al.Association between ovocalyxin-32 gene haplotypes and eggshell quality traits in an F2intercross between two chicken lines divergently selected for eggshell strength [J].Anim Genet,2010,41(5):541-544.

[10] Dunn I C,Joseph N T,Bain M,et al.Polymorphisms in eggshell organic matrix genes are associated with eggshell quality measurements in pedigree Rhode Island Red hens [J].Anim Genet,2009,40(1):110-114.

[11] Uemoto Y,Suzuki C,Sato S,et al.Polymorphism of the ovocalyxin-32 gene and its association with egg production traits in the chicken [J].Poultry Science,2009,88(12):2512-2517.

[12] Dunn I C,Rodríguez-Navarro A B,Mcdade K,et al.Genetic variation in eggshell crystal size and orientation is large and these traits are correlated with shell thickness and are associated with eggshell matrix protein markers [J].Anim Genet,2012,43(4):410-418.

[13] Yang K T,Lin C Y,Liou J S,et al.Differentially expressed transcripts in shell glands from low and high egg production strains of chickens using cDNA microarrays [J].Anim Reprod Sci,2007,110(1):113-124.

[14] 李俊营,詹 凯,李绍全,等.淮南麻黄鸡30周龄蛋品质性状相关分析 [J].中国农学通报,2011,27(32):10-13.

Li J Y,Zhan K,Li S Q,et al.Correlated analysis on egg quality traits of Huainan partridge chicken at 30 weeks age [J].Chinese Agricultural Science Bulletin,2011,27(32):10-13.(in Chinese)

[15] 张向楠,孙 伟,储明星,等.绵羊催乳素受体基因外显子10多态性及其与产羔数相关分析 [J].中国畜牧杂志,2012,48(17):1-6.

Zhang X N,Sun W,Chu M X,et al.Analysis on genetic polymorphism of exon 10 of prolactin receptor gene and its relationship with litter size of sheep [J].Chinese Journal of Animal Science,2012,48(17):1-6.(in Chinese)

[16] Wellman-Labadie O,Picman J,Hincke M T.Antimicrobial activity of cuticle and outer eggshell protein extracts from three species of domestic birds [J].Br Poult Sci,2008,49(2):133-143.

[17] 左珂菁,张祥斌,冀 君,等.禽抗微生物肽的结构、分布及活性研究进展 [J].生物技术通报,2008(4):38-46.

Zuo K J,Zhang X B,Ji J,et al.Avian antimicrobial proteins:Structure,distribution and activity [J].Biotechnology Bulletin,2008(4):38-46.(in Chinese)

[18] Takahashi H,Yang D,Sasaki O,et al.Mapping of quantitative trait loci affecting eggshell quality on chromosome 9 in an F(2) intercross between two chicken lines divergently selected for eggshell strength [J].Anim Genet,2009,40(5):779-782.

[19] Fulton J E,Soller M,Lund A R,et al.Variation in the ovocalyxin-32 gene in commercial egg-laying chickens and its relationship with egg production and egg quality traits [J].Anim Genet,2012,43(Suppl.1):102-113.