黑鲷不同组织的9种同工酶谱

杨从戎, 苗 亮, 李明云

(宁波大学 应用海洋生物技术教育部重点实验室, 浙江 宁波 315211)

黑鲷(Sparusmacrocephalus)属鲈形目(Perciformes)、鲷科(Sparidae)、鲷属(Sparus)，俗称黑加吉、黑鳅、黑立，多栖息于泥沙底质或岩礁聚集的浅海岸边，属暖水性底层鱼，分布于中国、日本沿海及朝鲜半岛。黑鲷食性杂、生长迅速、抗病力和适应性强，适合沿海网箱和池塘养殖，加上其肉质与口感极佳、营养丰富、适宜垂钓，深受广大消费者的喜爱，因此具有很高的经济价值。20世纪末，由于黑鲷育苗试验的成功，在中国沿海各地，黑鲷养殖得到了快速发展，逐渐成为国内一种重要的海水养殖品种[1]。目前，有关黑鲷的研究主要集中在繁育和养殖等方面[2-5]，而有关黑鲷同工酶方面的研究仅见王可玲等[6]对黑鲷等5种海水鱼同工酶表达的简单分析，但未对黑鲷同工酶的组织表达差异做详尽描述。

同工酶(isozyme)是指由一个或多个基因座位编码、催化同一生化反应、在电场中的运动存在多种可分离形式的酶[7]，同工酶分析是研究生物生化遗传特征的主要方法之一。目前已对多种鱼类进行了同工酶分析[8]，研究的同工酶种类也较多，其中在生理学和组织特异性研究方面，多使用乳酸脱氢酶(LDH)、醇脱氢酶(ADH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、苹果酸酶(ME)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、酯酶(EST)、半乳糖脱氢酶(GAD)、甲酸脱氢酶(FDH)等同工酶进行分析和比较[9, 10]。

笔者分析了上述9种同工酶在黑鲷不同组织中的表达情况，以期为黑鲷的生化遗传分析、种质资源保护等研究提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与样品制备

实验用黑鲷购自浙江省宁波市路林水产市场，共10尾，平均体重482 g，断尾放血后立即在冰上解剖，取眼睛、鳃、脑、心、肾、脾、肝、肠和肌肉等9种组织，按1∶ 3的比例(W/V)加入pH值7.0，0.1 mol/L的PBS，冰浴条件下充分匀浆后以15 000 r/min低温(4℃)离心30 min(部分组织须多次离心至酶液澄清)。吸取上清酶液，加入等体积的40%甘油及1/10体积的0.1%溴酚蓝电泳指示剂后电泳分析。

1.2 电泳、染色

实验采用不连续聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳法，其中浓缩胶pH值为6.8，浓度为3.6%；分离胶pH值为8.8，浓度为8.2%。电极缓冲液为pH值8.3的Tris-甘氨酸缓冲溶液。电泳在冰浴中进行，起始电压为150 V。当溴酚蓝指示带进入分离胶后，将电压升高至350 V。约2 h后，待指示带至玻璃板底部2～3 cm处，结束电泳，立即进行染色。染色参考王中仁[11]的方法进行，略加修改，之后用7.5%冰醋酸溶液终止染色并固定，扫描仪扫描、记录。

1.3 结果记录

染色后的凝胶经7.5%冰乙酸溶液脱色固定后凝胶成像，记录酶带的迁移距离和颜色深度。同工酶的缩写、命名采用胡能书等[12]的方法，从阴极到阳极依次命名为1,2,3…。

2 结果

2.1 乳酸脱氢酶(LDH E.C.1.1.1.27)

由图1可见，黑鲷的9种组织中均有LDH表达，共检测到15条酶带。其中眼和脑条带复杂，有多条特异表达的条带；肌肉有3条带，其余组织均为1条带；心脏中LDH活性最高，肝脏中活性最低(图1)。

图1 黑鲷不同组织LDH图谱

2.2 醇脱氢酶(ADH E.C.1.1.1.1)

ADH是一种催化醇脱氢形成醛或酮的酶，一般为二聚体酶，在黑鲷各组织中共表现出4个条带。Adh-1在各组织中均有检出，为基础性表达；Adh-2，Adh-3在眼、鳃、肾、脾、肝和肠道6个组织中表达，表现出二聚体特性；Adh-4只在眼睛中特异表达(图2)。

2.3 苹果酸脱氢酶(MDH E.C.1.1.1.37)

在黑鲷组织中可以检测到上清液型(s-MDH)和线粒体型(m-MDH)两种类型的苹果酸脱氢酶。m-MDH更靠近阴极，主要在鳃、脑、心、肾和肝中表达，但活性较弱。s-MDH靠近阳极，其中 s-Mdh-1在9个组织中都有表达，肝和肠中活性最强；s-Mdh-2只在肌肉和心脏中表达。9种组织中， s-MDh的活性高于m-MDh(图3)。

图2 黑鲷不同组织ADH图谱

图3 黑鲷不同组织MDH图谱

2.4 苹果酸酶(ME E.C.1.1.1.40)

ME在黑鲷9种组织中共检测到4个条带。其中Me-1和Me-2只在肾、肝、肠中特异性表达，活性较弱；而Me-3和Me-4在各组织中都有表达，肝脏中活性最强，眼中活性最弱(图4)。

图4 黑鲷不同组织ME图谱

2.5 超氧化物歧化酶(SOD E.C.1.15.1.1)

黑鲷的9个组织中SOD均有4条酶带，分为上清液型(s-SOD)和线粒体型(m-SOD)两种。 m-SOD为一条酶带；s-SOD为二聚体酶，由3个基因座位编码，表现为3条靠得很近的酶带(图5)。

2.6 过氧化物酶(POD E.C.1.11.1.7)

黑鲷眼、脑、肌肉和肠中均未检测到POD条带。其余5个组织中共出现5个条带，为单体或二聚体；其中Pod-1—Pod-4在这5个组织中都有表达，但活性差异较大；脾中活性最强，肝中活性最低；而Pod-5只在心脏中表达(图6)。

图6 黑鲷不同组织POD图谱

2.7 酯酶(EST E.C.3.2.1.1)

黑鲷的EST表型较复杂：心脏和肌肉组织中未检测到条带；在眼、鳃、脑中出现2～3个微弱条带；在肾、脾、肝、肠4个组织各有5～10个条带，其中肾和肠中条带最多；活性也是肾和肠中明显强于其他组织。(图7)。

图7 黑鲷不同组织EST图谱

2.8 半乳糖脱氢酶(GAD E.C.1.1.1.48)

黑鲷9种组织中均有GAD表达，共出现4条酶带。其中Gad-1、Gad-3、Gad-4在各组织中都有表达；Gad-2条带仅在肝脏中表达；肌肉中GAD活力明显弱于其他组织(图8)。

2.9 甲酸脱氢酶(FDH E.C.1.2.1.2)

黑鲷的FDH为二聚体酶，9个组织共有6条酶带，其中仅Fdh-2为基础表达，在9个组织中都有条带且活性差异不大；其余均为组织特异表达：Fdh-1仅在肝中表达，Fdh-3在肾和肠中表达，Fdh-4仅在肾中表达；Fdh-5、Fdh-6仅在眼中表达(图9)。

图8 黑鲷不同组织GAD图谱

图9 黑鲷不同组织FDH图谱

3 讨论

3.1 黑鲷同工酶表达的组织特异性

本文研究结果显示黑鲷具有较为完善的同工酶系统，这使得黑鲷对各种生存条件具有较好的适应性。机体在发育过程中各组织分化，导致了不同组织同工酶的特异性表达，从而能满足不同组织特定的生理功能。9种同工酶在不同组织中的表达差异详见表1。由表1可见9种同工酶按其生理功能在不同组织中表达活性和条带数量各有所不同。

LDH是一种糖酵解酶，主要与乳酸的产生和利用有关。肌肉是机体无氧代谢较为旺盛的组织，黑鲷肌肉中LDH表现出3条酶活较强的条带，主要作用是催化丙酮酸转化为乳酸，参与无氧代谢；心脏中LDH酶活最高，这是因为LDH还能催化乳酸氧化形成丙酮酸，参与有氧代谢。LDH在肌肉和心脏中大量表达的情况与金春华等[13]对大弹涂鱼LDH研究结果相一致。一般认为C基因控制的LDH表型在部分鱼类的眼和肝脏中表达[9]，而这与黑鲷眼组织中特异的Ldh-15条带对应。同时在黑鲷脑组织中，存在数量较多且活性较弱的大量条带，可能是由于有副带或实验误差的原因，需要进一步实验进行验证。ADH也是种无氧代谢相关的酶，在缺氧的情况下可将体内多余的丙酮酸转化成乙醇，从而避免机体因丙酮酸积累而中毒死亡。在黑鲷各组织中，心脏ADH酶活最强，这与黑鲷较强的耐低氧能力相一致。

表1 黑鲷9种组织9种同工酶活力与条带数量比较

注：“+++”：活性强；“++”：活性较强；“+”：有活性条带不清晰；“***”：条带数量多；“**”：条带数量较多；“*”：较少或一个条带；“-”：无条带或无活性。

MDH和ME是生物氧化的重要酶类，分别负责草酰乙酸和苹果酸的相互转化以及苹果酸转化成丙酮酸过程。黑鲷的MDH为二聚体，分为上清液型和线粒体型，两种类型的酶分别由两种基因座位编码，在脏和肠组织中活性最高。ME是四聚体酶，由4个基因座位编码，同样也在肝和肠组织中活力最强。

SOD、POD、EST这3种酶与机体的免疫解毒功能密切相关。黑鲷SOD同工酶表型特征为在各组织中皆有表达，且酶活较强。李明云等[14]在香鱼的研究中发现SOD在脾脏和肝脏的活性较强，而肌肉等组织中未见表达，这种表达差异可能和两者生存环境以及生物学特性有关。POD能利用过氧化氢氧化嘌呤、酚类和胺类等有毒物质，以减轻这类物质对机体的毒害作用[15]，黑鲷的POD在脾中有大量表达，预示着脾组织中存在着较强的和过氧化氢氧化相关的免疫代谢。EST是一种水解酶，主要作用催化脂类水解。黑鲷的肾脏和肠道中存在大量EST的表达，与酯酶主要参与解毒与消化功能相关。GAD与FDH在黑鲷各组织中表现出各组织中皆有表达且活性较弱的特性，这可能与这2种同工酶所控制的甲酸代谢和半乳糖代谢在黑鲷体内代谢水平较低有关。

3.2 眼和肠组织中的同工酶表达特性及生理意义

眼是鱼类视觉的感觉器官，虽然不参与体内其他生命活动，但对生物体意义重大；在同工酶表达上，也存在一定的特异表达，例如在大部分鱼的眼组织中存在特异的C基因控制的LDH表型[9]。黑鲷眼组织同工酶表达特征是同一种同工酶具有多种表达，但活性不高，例如ADH和LDH图谱中，眼都是条带数量最多的组织，但酶活不是最强。分析其原因，可能因为眼是暴露在体表的器官，增加了外界病原体侵袭和环境刺激的机会，且眼组织比较敏感，因此这种同工酶表达特性，有助于眼组织及时处理各种应激，确保眼功能的稳定。

硬骨鱼类肠组织主要负责消化功能，但由于本身没有肠腺，只有依靠肠本身的上皮细胞分泌酶类参与消化，因此肠道中自身分泌着大量消化酶参与食物的消化和吸收。此外，肠组织还具有免疫功能，例如免疫屏障(免疫活性细胞、抗体系统等)、生物屏障(正常菌群共生)、化学屏障(胃酸及糖蛋白等)、物理屏障(粘液、吸附、再生、运动)，因此实际上肠组织是硬骨鱼类最大最复杂的免疫器官[16]。在同工酶研究中，一般以眼睛、肌肉、鳃、心脏、肝脏、肾脏和脾等组织作为研究对象[6,13]，对肠组织的同工酶研究鲜有报道。管丹东[17]和董旭辉[18]对大黄鱼和鬼鮋进行同工酶研究时对肠组织进行过取样检测，但未系统分析肠组织同工酶表达特性。本实验对黑鲷肠组织的同工酶表达模式作了较为详细的研究。结果显示在所详细研究的9种同工酶中，除了POD外，其他8种同工酶在肠组织中都有表达，且活性很强。肠组织相比其他组织，具有更为完善的同工酶系统，这正和肠组织消化吸收以及免疫等重要的生理功能相适应，说明肠组织中存在着较为旺盛的代谢活动。该研究结果可为黑鲷等鱼类肠组织功能及其相关的研究提供参考。

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