胫骨神经损伤对骨折愈合过程中CGRP表达的影响

吴洪亮李宗泽

（1 南昌大学第四附属医院关节外科，江西 南昌 330003；2 江西省瑞金市人民医院骨科，江西 瑞金 342500）

胫骨神经损伤对骨折愈合过程中CGRP表达的影响

吴洪亮1李宗泽2

（1 南昌大学第四附属医院关节外科，江西 南昌 330003；2 江西省瑞金市人民医院骨科，江西 瑞金 342500）

目的 研究胫骨神经损伤后大鼠胫骨骨折骨痂中CGRP的表达。方法 将SD大鼠40只分为2组，实验组20只和对照组20只，分别于骨折术后7、14、21、28 d处死大鼠，在骨折处取骨痂标本，观察胫骨骨折愈合过程中胫骨神经损伤时降钙素基因相关肽（CGRP）表达变化。结果 对照组骨折后7 d在愈伤组织中即可见到降钙素基因相关肽（CGRP）阳性神经纤维，沿血管分布，14～21 d在编织骨边缘有大量的CGRP阳性神经纤维，28 d时仍有较高水平。研究组除骨折后7 d骨痂中见CGRP阳性表达外，以后骨痂中CGRP表达逐渐下降，其中术后14、21、28 d两组组间CGRP表达量比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。结论 在骨折愈合过程中，骨折合并周围神经损伤不利于骨折愈合，周围神经对骨折的愈合起着重要的调节作用。

神经损伤；骨折愈合；降钙素基因相关肽

近年来，研究发现在骨折愈合过程中周围神经系统起到了重要的作用[1]，其主要通过肽能神经分泌的相关神经肽对骨组织起作用[2]，而CGRP在骨组织中分布最广，并且主要分布在骨代谢活跃的部位。CGRP通过调节成骨细胞和破骨细胞的分化及活性，从而影响骨折愈合。本实验通过对40只SD大鼠建立失神经支配的胫骨骨折模型，研究外周神经对胫骨骨折愈合的影响，为改善神经功能促进骨折愈合提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验分组及模型建立：选取SD成年健康大鼠40只，体质量300 g左右，雌雄不限，随机数字表法分成2组：左侧胫骨骨折组+左侧胫骨神经损伤组（实验组，20只）和单纯左侧胫骨骨折组（对照组，20只）。各组大鼠均用10%水合氯醛350 mg腹腔注射麻醉。A组在无菌条件下从胫骨平台前缘插入一根预制的消毒医用克氏针，然后人工固定大鼠后肢。助手将重锤于30 cm高处沿中轴自由落下，通过撞击托盘将力传导至刀片上，撞击胫骨中段造成骨折，胫骨中段前方最高点处为暴力撞击点，建立左侧胫骨骨折模型[3]。B组常臀部规备皮消毒后，外侧行长约1.5 cm的斜形切口，切开皮肤及皮下组织，将坐骨神经钝性分离，于梨状肌出口以远1 cm处横断切除坐骨神经远段约0.5 cm，生理盐水冲洗伤口后在皮下进行远端翻转缝合，建立左侧胫骨骨折合并胫骨神经损伤模型[4]。术后将所有实验动物分笼喂养，并注意保温，术后连续3 d肌内注射青霉素，每日3次。为防止感染，局部应用碘伏消毒伤口。自来水、市售固体饲料喂养。

1.2 骨痂标本制取：各组大鼠分别于建立实验模型后7、14、21、28 d，截取胫骨骨折部上下5 mm部位的组织，同时保护好骨膜，避免破坏骨痂。去尽软组织后用4%多聚甲醛固定液固定24～48 h，用10%乙二胺四乙酸钠充分脱钙。至针头轻易扎穿骨皮质后，梯度乙醇脱水，二甲苯置换，石蜡包埋，连续纵行4 μm组织切片，附着于载玻片上置入4 ℃的冰箱中备用。

1.3 X线片检查：分别于术后7、14、21、28 d对各组动物骨折侧行X线摄片检查，严格控制拍片条件：55 kv，10 ms，1.6 mAs，焦距90 cm。观察各组动物骨折处的骨痂生长情况。

1.4 HE染色组织学观察：将切片放入二甲苯中将石蜡除去，再经95%乙醇到80%乙醇，最后用蒸馏水冲洗。用苏木精水溶液染色10 min，自来水冲洗5 min，镜检，若胞质过蓝则以1%盐酸酒精分化30 s，自来水冲洗5 min。伊红染液染色5 min，若胞质过红则以无水酒精分化数秒钟，自来水冲洗。切片经梯度酒精脱水，再次放入二甲苯中，使切片透明。将中性树胶滴在透明切片上，盖上盖玻片封固。光镜下观察细胞核呈兰色，细胞质呈红色。观察骨细胞数量和骨小梁排列。

1.5 免疫组化检测CGRP的表达：采用SP法，石蜡切片脱蜡至水，在室温下，3%过氧化氢孵化10 min，蒸馏水清洗3次，复合消化液消化20 min抗原修复，滴加正常山羊血清封闭在室温下20 min，倒掉血清。滴加一抗工作液置于湿盒内4 ℃过夜，次日再置于37 ℃中1 h。滴加二抗工作液37 ℃孵育20 min，滴加链霉卵白素37 ℃孵育30 min。最后用新鲜配制的DAB液显色，苏木精再次染色，常规脱水透明，中性树胶封片封片，镜检。

1.6 统计学处理及图像分析：应用统计软件SPSS16.0进行统计分析，所有数据均采用均数±标准差（）表示。计量资料使用两样本t检验进行统计学分析处理，

2 结 果

2.1 大体观察：所有动物术后给予青霉素肌注、碘伏消毒伤口，饲养盒单独喂养，所有大鼠均无1例感染。但对照组伤口愈合速度实验组快，实验组术后肿胀程度及比对照组重，而且持续时间长。

2.2 X线检查结果：X射线检测，术后7天两组均无明显骨痂生长，断端清晰明确；术后14 d两组骨折端均出现局部高密度影，附近存在骨膜反应，骨痂量实验组较多，部分突出于骨皮质表面，但密度较差且不均匀；术后21 d实验组骨痂量较多，部分继续增大突出，但对照组正常生长，密度较实验组均匀；术后28 d实验组骨架过度生长，明显突出正常骨皮质，密度不均，外骨痂吸收塑形差，对照组骨折线模糊消失，外骨痂塑形逐渐成熟，密度较均匀，基本接近正常骨皮质。

2.3 免疫组织化学观察：对照组术后7 d骨痂组织中即可见CGRP阳性表达，沿血管分布；术后14、21 d均有大量CGRP免疫阳性神经纤维分布，术后21 d较术后14 d时减少；术后28 d仍然较多；实验组仅术后7 d骨痂中可见低水平的CGRP阳性表达。分析结果显示，术后14、21、28 d两组间CGRP表达量比较差异均有统计学意义（P＜0.05）。结果见表1。

3 讨 论

CGRP可调节生长板软骨细胞的增生、分化及凋亡，同时，通过对成骨细胞、破骨细胞的数量和活性的调节，使成骨细胞和破骨细胞的活性和数量达到平衡，使骨小梁正常重建，共同完成骨骼的形成和塑形过程；同时，CGRP可间接调节骨的矿物质代谢与平衡，促进基质的矿化。本实验组织学观察：对照组术后14 d骨小梁形成增加，成熟度较高，排列成栅栏状；术后21 d新生骨小梁己相互连续，排列基本规则；术后28 d骨折处新骨连接成片，组织结构基本接近正常组织。室验组各时间点骨小梁生长稀疏，排列不规则，类骨质较厚，成熟度不高，同时可见骨吸收空腔。进一步证实周围神经损伤对骺板的正常发育造成了一定的影响，限制了骨骼的纵向生长；同时，实验组较对照组骨基质矿化质量下降，进一步在组织学方面证实了，骨痂愈合过程中骨形成受到受限并骨质出现疏松。

本实验研究发现对照组术后14、21 d有大量CGRP免疫阳性神经纤维分布，术后28 d水平仍然较高，而实验组仅术后7 d有极少CGRP表达，术后7、21、28 d两组比较均有显著差异（P＜0.05）。进一步证实，周围神经损伤后，CGRP分泌进行性减少、消失，对骺板生长发育调控作用消失，影响骨骼生长。这证明了周围神经组织通过神经肽物质对骨折愈合发挥着重要的调控作用。

表1 CGRP免疫组化染色的平均光密度值比较（x¯±s）

[1] 杨文彬,韦财.锁定钢板内固定治疗复杂性胫骨平台骨折36例的疗效分析[J].广西医学,2012,34(8):1031-1033.

[2] 杨亚东,周娟,高辉,等.失神经支配在大鼠骨折愈合过程中降钙素基因相关肽对骨保护破骨细胞分化因子影响的实验研究[J].中华手外科杂志,2012,28(4):233-237.

[3] 费琴明,陈统一,陈中伟.大鼠胫骨标准骨折模型的制作[J].上海实验动物科学,2002,22(1):10-12.

[4] 汤池,姜保国,王天兵,等.中枢和周围神经损伤对降钙素基因相关肽含量及骨折愈合的影响[J].中华创伤杂志,2008,24(11):888-892.

R683.42；R745

：B

：1671-8194（2014）32-0068-02