温针灸百会穴和神门穴对癫痫大鼠细胞凋亡因子P53的影响*

何清溪，马冰宇，苏 欣，程为平

(1．黑龙江中医药大学，黑龙江哈尔滨150040;2．黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江哈尔滨150040)

本研究通过温针灸百会、神门穴对点燃癫痫大鼠模型进行治疗，观察探讨温针灸百会、神门穴对癫痫大鼠细胞凋亡因子P53含量变化的影响，从而阐明温针灸百会、神门穴的抗癫痫作用及对脑保护的意义，进而完善温针灸治疗癫痫的方法。

1 材料和方法

1．1 实验动物

应实验要求采用成年健康雄性SD大鼠36只，体重(200±15)g。

1．2 实验环境

室温(23．00 ±4．78)℃，湿度(12．30 ±4．06)%的房间。

1．3 实验药品与仪器

毫针(规格32号，苏州医疗用品厂)，艾条(由南阳市卧龙汉医艾绒厂提供)，戊四氮(由sigma公司生产)，多聚甲醛(北京益利精细化学品公司生产)，BCL－2、BAX、P53免疫组化试剂(由武汉博士德生物工程有限公司生产)。

1．4 癫痫模型的制备

癫痫模型制备使用随机抽取30只大鼠，腹腔注射阈下剂量 PTZ(戊四氮)35．0 mg/kg，每天1次，注射20～29天时达点燃标准，注射后观察30～50 min，根据大鼠癫痫发作的行为表现，参照Racine［1］的6级评分标准:0级:无任何反应;Ⅰ级:面部抽搐及咀嚼;Ⅱ级:点头和(或)甩头;Ⅲ级:前肢阵挛，但无直立位;Ⅳ级:前肢阵挛伴伸直;Ⅴ级:前肢及全身阵挛，失去平衡，跌倒。Ⅰ至Ⅲ级为轻型发作，Ⅳ级以上为重型发作。点燃标准:大鼠连续5次腹腔注射PTZ，均表现为Ⅳ级以上发作。

其余6只按10 ml/kg腹腔注射0．9%的生理盐水。

1．5 分组

造模成功后将大鼠随机分为6组:温针灸10天组6只，温针灸20天组6只，针刺10天组6只，针刺20天组6只，模型组6只，空白组6只。

1．6 治疗方法

大鼠穴位根据《实验针灸学》中大鼠常见针灸穴位定位。百会穴定位:顶骨正中，皮下有第3、第4颈脊神经分支、枕小神经及颈外动脉、静脉分支分布。神门穴定位:前肢内侧腕部横纹尺骨边缘皮下有腕尺侧屈肌，有尺动脉、尺静脉及尺神经掌支分布。直刺1 mm［2］。

治疗时间为大鼠处于癫痫发作间歇期时，分别将各组的大鼠捆缚于鼠板上，待大鼠固定安静后，温针灸组选取百会穴和双侧神门穴，毫针针刺穴位，持艾条于穴位上方2～3 cm处悬灸，采用温和灸法，得气为大鼠出现疼痛及抽搐反应，每穴每次15 min。针刺组同样固定后，仅针刺穴位每穴留针15 min。各治疗组于造模后第2天开始治疗，每日1次，10天组治疗连续10天后停止，20天组连续治疗20天。模型组、空白组不给予任何治疗。

1．7 免疫组化法测定大脑海马回中P53的含量

治疗结束后分别将空白组、针刺组及温针灸组的大鼠麻醉，开胸暴露心脏，心尖插入灌注针头，剪开右心耳，注入生理盐水200 ml，冲出血液后缓慢灌注4%多聚甲醛200 ml固定，大鼠内脏僵硬后剪下头部取脑，制成脑切片，采用免疫组化法测定海马回中P53的含量。

1．8 统计学处理

各组数据均应用SPSS17．0软件处理，组间比较采用t检验，结果数据以均数±标准差表示。

2 结果

2．1 治疗后大鼠大脑海马回脑切片中P53水平的变化

模型组与空白组大鼠大脑海马回脑切片中的P53相比有显著性改变，经检验有统计学意义(P＜0．01)，见表1，提示癫痫大鼠造模成功。

温针灸10天组、20天组分别与模型组大鼠大脑海马回脑切片中P53水平比较有显著性改变，经检验有统计学意义(P＜0．01)，见表1，提示温针灸组对P53水平有影响，即温针灸百会及双侧神门穴可以改善癫痫大鼠大脑海马回脑切片中P53水平。

针刺组与模型组大鼠大脑海马回脑切片中P53比较有显著性改变，经检验有统计学意义(P＜0．05)，见表1，提示针刺组对P53水平有影响，即针刺百会及双侧神门穴可以改善癫痫大鼠大脑海马回脑切片中P53水平。

温针灸组与针刺组大鼠大脑海马回脑切片中P53水平显著性改变，经检验有统计学意义(P＜0．05)，见表1，提示温针灸组优于针刺组。

表1 各组大鼠海马P53阳性细胞平均灰度值(±s)

表1 各组大鼠海马P53阳性细胞平均灰度值(±s)

注:与模型组比较，*P ＜0．05，＊＊P ＜0．01。

P53空白组 6 174．00 ±7．34组别 n＊＊模型组 6 144．16 ±7．54针刺10天组 6 157．66±13．35*针刺20天组 6 158．16±14．04*温针灸10 天组 6 165．33±6．62＊＊温针灸20 天组 6 173．33±4．88＊＊

2．2 不同时间点各参数的变化

治疗方法相同而治疗时间不同的各组间比较，温针灸10天和温针灸20天，针刺10天和针刺20天的两两比较，均无显著性差异(P＞0．05)，无统计学意义。提示温针灸及针刺百会及神门穴对癫痫大鼠海马P53含量的影响作用在治疗10天后作用减弱，趋于稳定。

2．3 实验大鼠的行为学改变

实验过程中大鼠行为学改变:存活大鼠中，所有空白组大鼠均无痫性发作。其余点燃成功并存活的大鼠，随着PTZ注射次数增加而发作级别逐渐升高，最后出现全身强直－阵挛发作。模型点燃成功后停止刺激5～7天，再次给予PTZ刺激，仍可出现4级以上发作，此即是为模型点燃成功的表现。在给予温针灸及针刺治疗后，温针灸组大鼠的发作次数均较模型组减少，发作级别也较治疗前有所下降，模型组几乎每日仍可见3级以上发作。提示温针灸对PTZ致痫大鼠行为改善有显著影响。

3 讨论

癫痫发作后神经细胞凋亡受多种基因的调控。野生型P53基因是其存在于细胞内的正常状态，具有转录因子的功能;作为某些抑制细胞增殖基因的反式激活因子对细胞分裂进行负调控;同时它监视着细胞基因的完整性，抑制细胞周期推进或诱导细胞凋亡［3］。当DNA损伤时表达产物增加，抑制细胞周期运转，导致凋亡细胞解体［4］。P53基因连接于BAX启动子上，导致 Bax/Bcl－2比例增大，加强凋亡［5］。KA(Kainic acid，红藻氨酸)致痫大鼠海马细胞中BCL－2在癫痫发作6 h以内明显升高，这种变化可能对损伤和凋亡细胞有保护作用。随着P53表达的升高，BCL－2呈现下降趋势。

中医学认为癫痫为脑神被扰、神明失司的发作性疾病，间歇期酌情选用针灸治神之方，即督脉的神庭，心经的神门，督脉的神道、至阳，扬刺百会从而脑神得安，神明有司，而痫去体安［6］。《针灸甲乙经》中则提出了“治之，补其不足，泻其有余，调其虚实，以通其道，而去其邪”，调补脏腑阴阳的虚实，平衡阴阳，以使神志正常［7］。

百会穴居巅顶部，为百脉之宗，具有益气升阳、填髓充脑、开窍醒脑的作用。神门穴位于掌后锐骨端凹陷中，可输布“原气”，濡养心神。百会穴与神门穴配伍可有提达阳气、开窍醒脑、益智宁神之效。

本研究表明温针灸组癫痫样发作等级明显降低。空白组与模型组、模型组与温针灸组相比较大脑海马回脑切片P53含量均有显著改变，温针灸组与针刺组相比P53水平显著改变。证明戊四氮致痫大鼠的机制与P53有相关性，温针灸百会及双侧神门穴可以改善癫痫大鼠细胞凋亡因子P53水平，温针灸百会及双侧神门穴对治疗癫痫大鼠有意义。其机制可能与细胞凋亡因子P53改变有关。但是细胞因子机制十分复杂，细胞凋亡因子对癫痫的影响是多方面的，同时不排除实验误差导致的改变，值得进一步研究。

［1］ Racine RJ．Modification of seizure activity by electrical stimulation:II．Motor seizure［J］．Electroencephalography and clinical neurophysiology，1972，32(3):281 －294

［2］ 李忠仁．实验针灸学［M］．北京:中国中医药出版社，2003:327－329

［3］ 张丽萍，夏猛．癫痫发病与细胞凋亡调控因子P53，Bcl－2，Bax关系的中西医研究进展［J］．四川中医，2006，24(7):35 －36

［4］ Erster S，Mihara M，Kim RH，et al．In vivo mitochondrial p53 translocation triggers a rapid first wave of cell death in response to DNA damage that can precede p53 target gene activation［J］．Molecular and cellular biology，2004，24(15):6728 －6741

［5］ Sloviter RS．Possible functional consequences of synaptic reorganization in the dentate gyrus of kainate － treated rats［J］．Neuroscience letters，1992，137(1):91 －96

［6］ 程光宇．《内经》针灸治痫心悟［J］．针灸临床杂志，2012，28(5):6－7

［7］ 马艳春，周波，宋立群，等．《针灸甲乙经》学术思想及针灸治疗癫痫的探究［J］．针灸临床杂志，2011，27(12):42 －44