山羊源奥斯陆莫拉菌的分子鉴定与分析

张素辉,黄勇富,付利芝,沈克飞,徐登峰

奥斯陆莫拉菌(Moraxella osloensis)为革兰氏阴性球杆菌，是Henriksen于1967年在奥斯陆发现的，该菌是人和动物黏膜上的正常菌群，可从健康成年人的鼻腔和门诊病人的耳朵、咽喉、气管、血液等分离到[1-4]。奥斯陆莫拉菌对头孢曲松高度敏感，主要在机体抵抗力及免疫力降低时，引起呼吸系统、泌尿生殖等多系统感染，同时可能导致脑膜炎、心内膜炎、肺炎、腹膜炎、阴道炎、骨髓炎、化脓性关节炎及菌血症等[5]。临床病例中有近一半患病对象是儿童[6]。目前，国内关于奥斯陆莫拉菌对山羊的危害还未见报道，本研究对重庆市某羊场送检临床肺炎病例病山羊的病原微生物进行了分离培养，通过分子检测方法鉴定，该山羊肺炎病例病原菌为奥斯陆莫拉菌。

1 材料与方法

1.1试验动物 4只20 d龄的健康羔羊，购自荣昌某羊场。

1.2试验试剂 小牛血清琼脂平板培养基，LB培养基均由本实验提供；PCR反应试剂2×Taq PCR Master Mix、DNA抽提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；青霉素等20种药敏纸片购自自上海卫生技术服务公司生物试剂所；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自广州东盛生物科技有限公司；16S rDNA的PCR扩增引物为通用引物，预期扩增片段大小为1.5 kb左右，由大连宝生物工程有限公司合成。引物序列为：

F27：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，

R1492：5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’

1.3病原菌的分离纯化 实验室解剖送检肺炎病例山羊，对肺脏化脓部位进行无菌划线接种于普通琼脂平板和小牛血清琼脂平板上，37 ℃恒温培养24～48 h，观察细菌的生长情况，并将分离菌进行纯化培养。

1.4致病性试验 将分离到的病原菌接种到含有小牛血清的肉汤培养基培养中 ，37 ℃，250 r/min摇床培养48 h后，取6 mL菌液4 000 r/min离心5 min，收集菌体，再用生理盐水稀释到原有浓度。选取4只健康的20日龄的羔羊，分为两组，然后选取3只羔羊通过气管注射上述菌液，2 mL/只，剩余的1只注射生理盐水作为对照，观察羔羊的健康情况。

1.5药敏试验 参照美国临床实验室标准化委员会标准，采用纸片法做药敏试验，取200 μL菌液涂布于小牛血清培养基平板上，并贴上药敏纸片，37 ℃恒温培养24 h后测定抑菌圈直径。主要检测了该菌对头孢曲松等29种抗生素的敏感性，抑菌圈直径<10 mm表示其对抗生素具有一定的耐药性，10～15 mm的为中度敏感，>15 mm的为高度敏感。

1.6病原菌的16SrDNA的 PCR扩增 取1.5 mL纯培养菌液离心，按DNA抽提试剂盒说明书提取基因组。在PCR反应体系为：2×TaqPCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各1 μL(50 μmol/L)，模板DNA 2 μL，加ddH2O至50 μL，在PCR仪中进行扩增。反应条件为：94 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火 45 s，72 ℃ 延伸45 s，30个循环，72 ℃延伸10 min，结束反应后4 ℃保存。PCR产物采用l0 g/L琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.7PCR产物的纯化与测序 将预期目的条带大小相符的PCR产物经胶回收试剂盒纯化后，送往大连宝生物工程有限公司进行DNA测序。

1.8系统进化分析 将分离菌株16S rDNA序列与GenBank中已知的相关核酸序进行分析比对，并利用生物软件MEGA5通过距离法构建系统进化发育树。

2 结 果

2.1菌株的镜检及培养特性结果 对纯化得到的菌株进行革兰氏染色后发现该菌为革兰氏阴性菌，呈杆状，短且宽，近椭圆形，单个、成对或呈短链状，镜检结果如图1所示。分离到的菌株在普通琼脂平板上生长十分缓慢，24 h后仍观察不到菌落，说明该菌对营养需求较高；在小牛血清琼脂培养基上生长48 h后，可观察到直径为2.0～2.5 mm的粘性菌落，如图2所示。

图1 革兰氏染色结果

图2菌落图片

Fig.2Bacterialcolony

(10× object glass)

2.2致病性试验 实验组的3只羔羊被接种病原菌以后，均在7 d左右开始发病，体温升高到40 ℃～42 ℃，出现眼、鼻黏膜变红，发干，流鼻液、咳嗽、喘气等呼吸道症状，无死亡现象，对照组的山羊无异常症状。对实验组的羊只进行肺脏病原菌的分离鉴定，通过革兰氏染色镜检发现分离到大量革兰氏阴性短杆菌，菌体呈单个、成对，亦有短链状。

图3 电泳结果

1: PCR amplification products of 16SrDNA;

M: DNA marker

2.3药敏试验 通过对分离的菌株进行药敏试验，发现其对头孢曲松等19种抗生素的敏感性较高，对甲氧苄啶等4种抗生素为中度敏感，对红霉素等6种抗生素敏感性较弱，表现出一定的抗性。试验结果见表1。

2.4菌株16S rDNA序列的扩增与鉴定 利用通用引物对该菌进行16SrDNA的扩增，得到大小为1 447 bp的片段，与预期结果一致，电泳结果如图3所示；扩增产物的核苷酸序列测序结果如图4所示。

表1 抑菌试验结果

Note: S--High sensitive; M--Medium sensitive; R--Resistant.

图4 PCR产物测序结果

2.5系统进化分析结果 将该菌的16SrDNA序列在GenBank进行序列比对，发现其与菌株JN084136同源性达99.9%。将该序列与相关菌属奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉克斯氏菌属(Moraxella)、俊片菌属(Lampropedia)、副球菌属(Paracoccus)的代表菌株16S rDNA进行序列比对分析，各代表菌株相关信息如表2，并利用生物软件MEGA5构建系统进化树，系统发育进化结果如图5所示。

表2 系统发育树的代表菌株及16rDNA序列信息表

3 讨 论

随着分子生物学的发展，现代细菌分类鉴定从传统的表型分类进入基因型分类水平，16S rDNA分析技术已成为研究生命系统进化及细菌分类的常用工具，16S rDNA系统发育学分析技术通过比较细菌核糖体DNA片段的同源性实现对细菌的分类学鉴定，理论上具有很好的可靠性[7]。本研究基于16S rDNA序列的同源性的比对表明，分离到的病原菌与各代表菌株的同源性均较高，其中与菌株JN084136同源性高达99.9%；通过构建系统发育进化树，可以发现实验分离菌株与Moraxella的代表菌株聚为一簇，Neisseria和Lampropedia位于另一分支，与实验分离菌株进化距离最近的菌株是Moraxellaosloensis(JN084136)，由此可以确定该分离菌为奥斯陆莫拉菌[8-9]。同时为今后奥斯陆莫拉菌性肺炎的PCR快速诊断方法的建立及该病的防治研究提供了可靠的试验数据。

目前，在国内关于奥斯陆莫拉菌以及它对山羊的生理机能危害的报道相对较少，可能的原因是该菌致病性不强，不会引起动物大规模的死亡，没有得到人们特别关注；或者是该病原菌可能对针对肺炎病例的药物较为敏感，相对易于治愈；同时该菌的对生长条件要求较为严格，不易分离。而且该病原菌引起的肺炎病例易与溶血性巴氏杆菌、支原体等病原引起的呼吸道病症相混淆，故目前临床上暂无奥斯陆莫拉菌致山羊疾病病例的报道。健康动物机体抵抗力较强时，不会因感染该病原菌而患病，当机体体抗力低下时，该菌会引发类似肺炎的症状，本次试验对羊只接种的菌的浓度较大，导致羊只出现了一定症状。奥斯陆莫拉菌可以造成人兽共患病，其对人体的危害还有待于进一步研究。

图5基于16SrDNA序列构建的系统发生树状图(Moraxellaosloensis(#)为分离病原菌)

Fig.5Phylogenetictreebasedon16SrDNAsequences(Moraxellaosloensis(#)isthepathogenicbacterium)

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