犬瘟热病毒病原学和诊断技术研究进展

孙礼 王妍慧

文献综述

犬瘟热病毒病原学和诊断技术研究进展

孙礼 王妍慧

（山东省莱阳市畜牧兽医局 265200） （山东省莱阳市畜牧兽医站）

犬瘟热病毒(Canine distemper virus, CDV)是引起犬科、鼬科及一部分浣熊科或其它食肉目动物犬瘟热(Canine distemper, CD)的病原[1]。幼龄未免疫动物感染CDV后多表现为急性致死性经过，临床上以双相热型、结膜炎、严重的呼吸系统和消化系统炎症，以及后期出现神经症状为主要特征，成年动物可耐过或呈慢性持续性感染。目前CDV在世界范围内呈广泛性流行，感染宿主的范围不断扩大，多种动物都能感染和传播该病原[2]。

1 病原学研究进展

1.1 病原分类及结构 CDV属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)，副粘病毒亚科(Paramyxovirinae)，麻疹病毒属(Morbillivirus)，与麻疹病毒(Measles virus，MV)、牛瘟病毒 (Rinderpest virus，RPV)、小反刍动物瘟疫病毒(Pestedes petits ruminants pestivirus，PPRV)、海豹瘟热病毒(Phocine distemper virus，PDV)、海豚瘟热病毒 (Porpoise morbillivirus，PMV)同属[3]。在病毒结构和超微形态上，CDV与MV和RPV是几乎完全相同的，三者亲缘关系最近，具有相似的分子生物学特征和抗原关系[4]。CDV病毒粒子形状多样，多呈球形或多形性，有时呈长丝状，直径为120~350 nm。病毒粒子中心含有主要由基因组RNA和核衣壳蛋白亚单位组成的螺旋状核衣壳，宽径约15~17 nm。目前，CDV只有一个公认的血清型，未见有新血清型被发现的报道，但是在感染犬病例中发现一些基因型的CDV强毒株具有不同毒力和细胞嗜性，说明CDV可能存在不同的血清型[5]。

1.2 基因组结构 CDV为不分节、非重叠的单股负链RNA病毒。病毒基因组全长为15690 bp，从3’端到5’端依次为3’前导序列(3’Leader sequence)，核衣壳(Nucleocapsid，N)基因、磷蛋白(Phosphoprotein，P)基因、基质膜蛋白(Membraneprotein，M)基因、融合蛋白(Fusionprotein，F)基因、血凝素蛋白(Hemagglutinin，H)基因和大蛋白(Largeprotein，L)基因六个蛋白编码序列，以及5’尾随序列(5’Trailer sequence)，磷蛋白基因(P)内部还有C和V两个非结构蛋白基因。其中3’端前导序列与5’端尾随序列指导基因的转录复制过程；N蛋白、P蛋白和L蛋白组成的螺旋形衣壳包裹负链RNA，形成核糖核蛋白复合体，这种复合体是病毒基本的感染单位，是病毒转录和复制所必需的[6]；H蛋白和F蛋白在病毒囊膜上形成与病毒的入侵和细胞毒性直接相关的纤突，具有吸附功能，能让病毒结合到细胞表面的受体上[7]。

1.3 主要蛋白及其基因 （1）血凝素蛋白(H)及其基因。H蛋白基因全长1947 bp，所有毒株起始密码子ATG均位于21~23位核苷酸处，但由于终止密码子在不同毒株存在差异，从而引起不同毒株H基因编码的氨基酸残基数不同[8]。野毒株和Convac株H基因编码607个氨基酸残基，而Onderstepoort疫苗株只编码604个氨基酸残基。目前CDV主要分为疫苗型(Vaccine)和Asia1、Asia2、USA(Ameri ca)、Europe、Arctic6个基因型[9]。Lednicky等[10](2004)对2000~2001年美国浣熊中流行的CDV野毒株研究发现，其H、F和P基因序列与CDV疫苗株在遗传距离上较远，在遗传系统发育树上处于USA(America)型的不同两个基因簇，建议将USA(America)型分为America 1和America 2基因型。赵建军等[11](2011)通过对中国狐、貉和水貂养殖场中CDV毒株进行血凝素基因的系统发育分析，在发育进化树上发现了有别于常见的6个基因型的HLJ1和HLJ2两个毒株，将其划分为Asia 3型。但是不同基因型的CDV在病原致病力和免疫原性等方面存在怎样的差异，目前还没有明确的研究结论。因此对H基因进行克隆测序分析，对于探讨犬瘟热免疫失败的原因和进行犬瘟热的流行病学监测具有重要的意义。H蛋白是CDV囊膜表面的一种构成囊膜纤突主要成份的Ⅱ型糖蛋白，相对分子质量为76 KD。H蛋白在病毒感染过程帮助病毒识别并吸附到细胞表面受体上，使囊膜与宿主细胞膜发生融合，与F蛋白一起协助CDV进入宿主细胞。von Messing等[12](2005)还发现位于H蛋白结构上临近的2个功能区的6个必需氨基酸残基起到识别宿主细胞受体并启动膜融合的作用。H蛋白作为CDV主要结构蛋白，可产生中和抗体，是细胞毒性T细胞作用的抗原决定部位，是宿主免疫系统识别的最主要的靶抗原。有研究表明，近年来犬瘟热暴发的一个重要原因可能是H蛋白上潜在的N-联糖基化位点的遗传变异，这些位点的差异可能直接影响了病毒的抗原性。因此目前大部分针对CDV抗原性变异的研究集中在H蛋白上。Panzera Y等[13](2011)报道所有南美CDV毒株与疫苗株氨基酸存在高差异，这种遗传变异可能是导致犬瘟热在接种疫苗的犬种群中死灰复燃的因素。Müller A等[14](2011)报道，在葡萄牙自由放养的狼中发现的CDV有家犬起源的血凝素基因特性，这表明这些狼的犬瘟热病毒来自本地狗，而不是从野生动物物种中传播的。Nikolin VM等[15](2012)结合全球范围内公布的138株CDV基因序列数据，调查犬瘟热病毒HA蛋白的SLAM结合区域530 (G/E到R/D/N)和549 (Y到H)位点的氨基酸替换对犬瘟热病毒由家犬适应株蔓延到其他食肉动物的重要性。但没有发现氨基酸530位点受到宿主物种的强烈影响的证据。（2）融合蛋白(F)及其基因。F基因全长2205bp，含有4个起始密码子，前三个是在所有毒株中均是完全保守的位于86~88、266~268、408~410核苷酸处的AUG，第四个起始密码子是461~463核苷酸处的AUA或AUG[16]。Cherpillod等[17](2004)应用基因突变技术，来研究CDV A75/17毒株和 Onderstepoort 疫苗株中F蛋白表达量与翻译起始密码子之间的关系，研究发现86-88位的AUG是F蛋白主要的翻译起始密码子，其使用频率是266-268位AUG的3倍，此外位于阅读框架内的两个甲硫氨酸(l和61位氨基酸)残基中的任何一个都是F蛋白有效表达所必需的。

F蛋白是CDV囊膜上的I型糖蛋白，分子量为62KD，由通过二硫键连接成异种蛋白二聚体的F1(45ku)和F2(23 ku)两个亚单位组成，其中F1蛋白位于囊膜的外侧，并且形成一个胰蛋白酶的特异酶切位点。F蛋白在CDV囊膜上呈纤突状，主要是协助CDV通过囊膜与细胞膜发生融合后穿过细胞膜侵染细胞。在麻疹病毒成员中，F蛋白的主要群特异性表位是麻疹病毒属异型免疫的主要交叉抗原。F蛋白上存在犬抗原提呈细胞最优先识别的辅助性T淋巴细胞表位，可诱导动物机体引起免疫反应，能阻止病毒在细胞内复制复制，从而抑制病毒感染，可用于研制基因工程亚单位疫苗[18]。（3）核蛋白(N)及其基因。N基因全长1683 bp，ORF起始于53~55位的AUG，终止于1677-1679位的UAA，编码523个氨基酸，蛋白分子量为58 KD。N蛋白是核衣壳的主要组成成分，与CDV的毒力密切相关，有包裹及保护内部基因的功能，而且N蛋白的中间保守区含有核衣壳包装和病毒 RNA核衣壳化所必需的信息。N蛋白1~8位氨基酸残基在CDV转运到细胞核过程中起了特别关键作用，因此N蛋白在CDV的结构和功能上起着极其重要作用。N蛋白是麻疹病毒属中较为保守的免疫原性蛋白，1~80位和337~358位氨基酸残基是N蛋白诱发抗体的主要抗原表位，可刺激动物机体产生早期中和CDV的抗体。此外，N蛋白上含有T细胞表位，在细胞免疫方面发挥着重要作用[19]。

2 诊断技术研究进展

2.1 病毒分离培养及鉴定 CDV分离培养是确诊该病最确切的诊断方法，几个来自不同物种和组织的细胞株和原代细胞已用于CDV的分离和感染，其中原代细胞主要有犬或貂的肺和腹腔巨噬细胞、外周血淋巴细胞、肾细胞和鸡胚成纤维细胞等；传代细胞主要包括非洲绿猴肾细胞(Vero)，狨猴淋巴样细胞(B95a)，Madin Darby狗肾细胞(MDCK)，犬巨噬细胞(DH82)。但最有效的方法是用幼犬或雪貂的肺脏巨噬细胞进行病毒分离[20]。分离后的病毒通常可以结合电镜观察、抗原抗体反应、特异性核酸检测、动物回归试验等方法进行进一步的鉴定。传统的病毒分离鉴定技术的结果虽然准确可靠，但CDV易在外界环境中灭活，成功分离病毒到的难度很大，而且病毒分离培养及鉴定工作量较大，对试验条件要求较为苛刻，因此该方法不适于CDV的快速诊断，尤其不利于在基层CDV诊断工作中推广应用。

2.2 血清学检测方法 常用的检测CDV的血清学方法有琼脂扩散试验、血清中和试验(SN)、免疫荧光抗体法、胶体金试纸条、酶联免疫吸附试验等。免疫荧光技术可用于体外细胞培养物和患病动物脏器中的CDV检测，是目前国际通用诊断CDV的手段[21]。Damián等[22](2005)采用免疫组化法对患肺炎的犬瘟热病进行检测，认为该方法是诊断犬呼吸系统疾病的组织病理学方法的有效补充手段。ELISA方法可用于评估犬瘟热的免疫效果和疾病多方面的调查。Latha等[23](2007)用重组核蛋白建立了可在感染早期进行CDV诊断IgM-ELISA方法。李娜等[24](2007)将CDV核蛋白基因表达产物(GST-N)作为诊断抗原，建立了间接ELISA检测方法，重组核蛋白(GST-N)诊断抗原与常见的犬细小病毒阳性血清、犬副流感病毒阳性血清不发生交叉反应，具有较好的特异性。An等[25](2008)利用获得的2株单克隆抗体建立了胶体金试纸条诊断技术，并用巢式PCR进行比较，虽然敏感性(89.7%和85.7%)和特异性(94.6%和100%)略低，但该试纸条使用方便，不需要特殊的仪器设备即可完成诊断，而且使用成本较为低廉，所以更容易在临床上推广。

2.3 分子生物学检测方法 近年来，核酸杂交、聚合酶链式反应(PCR)、环介导等温扩增法(LAMP)、限制性酶切片段长度多态性分析(RFLP)等分子生物学技术广泛应用到CDV的诊断和疫苗毒与野毒株的区分中。Gaedke等[26](1997)用地高辛标记制作了针对CDV N基因的核酸探针，建立了CDV核酸探针原位杂交检测技术，原位杂交试验结果表明，单链RNA探针是目前检测组织中CDV RNA最敏感的探针。Stanton等[27](2002)应用半巢式PCR方法和免疫荧光法、病理组织学方法及免疫组化法比较，发现半巢式PCR方法更适于发病后的检测，能够在某种程度上区别疫苗株和流行株。SaitoTB等[28](2006)利用RT-PCR方法检测具有犬瘟热脑炎临床症状的犬的尿液，发现RT-PCR检测尿液样本比血清和白细胞更为敏感。Cho等[29](2005)采用RT-LAMP技术检测CDV基因组，以RT-PCR相对比，敏感性达100%，特异性为93.3%，但其检测时间更短，仅用1h，还可以进行位点检测。刘彩玉等[30](2011)根据GenBank中犬瘟热病毒H基因保守序列设计合成了内外2对引物，成功建立了犬瘟热病毒的RT-LAMP检测方法。该方法在60℃下50 min即可完成，与常规RT-PCR检测方法相比灵敏度高100倍。Wang F等[57](2011)使用的BamHI 限制性内切酶对CDV的核蛋白(N)基因的保守区进行RFLP分析，建立了区分CDV疫苗株与野毒株的RT-PCR-RFLP方法，并对中国毛皮动物中分离的CDV进行了亲缘关系分析。Yi L等[58](2012)建立了区分犬瘟热病毒疫苗和野毒感染的联合特异性RT-PCR技术，并对七个CDV中国株的血凝素基因进行了遗传特性分析，发现目前在中国家犬中流行的CDV是Asia1型。

3 问题与展望

随着我国犬、水貂，狐狸等大型养殖场的建立，在犬和毛皮动物中犬瘟热临床病例的数量迅速增加，目前犬瘟热已成为危害宠物业和特种经济动物养殖业最大的一种病毒性传染病。由于CDV传染性强，发病率高，感染会引起包括中枢神经系统、呼吸系统和胃肠道消化系统在内的全身性疾病，一旦发病，难以有效地治疗和控制。因此，建立有效的检测手段，开展犬瘟热流行病学监测，及时研发有效的疫苗、高免血清等生物制品是重要的发展方向。

[1] 陈溥言. 兽医传染病学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2006: 415-416.

[2] Adaszek L, Winiarczyk S, Maj J, et al. Molecular analysis of the nucleoprotein gene f canine distemper virus isolated from clinical cases of the disease in foxes, minks and dogs. Pol J Vet Sci,2009,12(4): 433-437.

[3] Fauquet CM, Mayo MA, Maniloff J, et al. Virus Taxonomy. VIIIth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses [M]. San Diego: Elsevier Academic Press. 2005.

[4] Lamb RA, Kolakofsky D .Paramyxoviridae: the viruses and their replication. In: Fileds BN, Knipe DM, Howley PM,Griffin DE (eds) Fields virology, 4th edn. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PA, 2001, 1305–1340.

[5] Lan NT, Yamaguchi R, Hirai T, et al. Relationship between growth behavior in vero cells and the molecular characteristics of recent isolated classified in the Asia 1 and 2 groups of canine distemper virus[J].Vet Med Sci,2009,71(4):457-461.

[6] Brown DD, Collins FM, Duprex WP, et al. Rescue of mini-genomic constructs and viruses by combinations of morbillivirus N, P and L proteins[J]. Gen Virol, 2005,86(4):1077-1081.

[7] 葛艳华. Asia-1型犬瘟热病毒分离株H蛋白免疫原性分析及重组犬腺病毒2型的构建[D].哈尔滨：东北农业大学，2009.

[8] Obeid OE,Partidos CD,Howard C R,et al.Protection against morbillivirus induced encephalitis by immunization with a rationally designed synthetic peptide vaccine containing B and T cell epitopes from the fusion protein of measles virus.J Virol,1995,69 (3):1420-1428.

[9] Lan NT, Yamaguchi R, Kawabata A, et al. Comparison of molecular and growth properties for two different canine distemper virus clusters, Asia 1 and 2 in Japan. J Vet Med Sci, 2007, 69(7):739−744.

[10] Lednicky JA, Dubach J, Kinsel MJ, et al. Genetically distant American canine distemper virus lineages have recently caused epizootics with somewhat different characteristics in raccoons living around a large suburban zoo in the USA. Virol J, 2004, 1: 2.

[11] Zhao JJ, Yan XJ, Chai XL, et al. Phylogenetic analysis of the haemagglutinin gene of canine distemper virus strains detected from breeding foxes, raccoon dogs and minks in China[J]. Vet Microbiol. 2010, 140(1-2):34-42.

[12] von Messling V, Oezguen N, Zheng Q, et al. Nearby clusters of hemagglutinin residues Sustain SLAM-dependent canine distemper virus entry in peripheral blood mononuclear cells. J Virol, 2005, 79(9): 5857−5862.

[13] Panzera Y, Calderón MG, Sarute N, et al. Evidence of two co-circulating genetic lineages of canine distemper virus in South America. Virus Res. 2012,163(1):401-404.

[14] Müller A, Silva E, Santos N, et al. Domestic dog origin of canine distemper virus in free-ranging wolves in Portugal as revealed by hemagglutinin gene characterization. J Wildl Dis. 2011,47(3):725-729.

[15] Nikolin VM, Wibbelt G, Michler FU, et al. Susceptibility of carnivore hosts to strains of canine distemper virus from distinct genetic lineages. Vet Microbiol. 2012,156(1-2):45-53.

[16] Plattet P,Cherpillod P,Wiener D,et al.Signal peptide and helical bundle domains of virulent canine distemper virus fusion protein restrict fusogenicity.J Virol,2007,81(20):11413-11425.

[17] Cherpillod P,Zipperle L,Wittek R,et al.An mRNA region of the canine distemper virus fusion protein gene lacking AUG codons can promote protein expression.Arch Virol,2004,149 (10):1971-1983.

[18] Evans SA, Belsham GJ, Barrett T. The role of the 5' nontranslated regions of the fusion protein mRNAs of canine distemper virus and rinderpest virus.Virology,1990,177(1):317-323.

[19] Yoshida E,Shin YS,Iwatsuki K,Gemma T, Miyashita N, Tomonaga K,Hirayama N, Mikami T, Kai C.Yoshida E, Shin Y S, Iwatsuki K, et al．Epitopesand nuclear localization analyses of canine distemper virus nucleocapsid protein by expression of its deletion mutants.Vet Microbiol,1999,66 (4):313-320.

[20] Whetstone CA, Bunn TO, Gourlay JA. Canine distemper virus titration in ferret peritoneal macrophages [J]. Cornell. Vet., 1981, 71(2): 144-148.

[21] 苏建青, 褚秀玲, 杨松涛等. 抗犬瘟热病毒荧光标记单抗的制备和初步鉴定[J]. 安徽农业科学, 2009, 37(8): 3552-3554

[22] Damián M, Morales E, Salas G, et al. Immunohistochemical detection of antigens of distemper, adenovirus and parainfluenza viruses in domestic dogs with pneumonia[J]. J Comp Pathol. 2005,133(4):289-293.

[23] Latha D, Geetha M, Ramadass P, et al.Development of recombinant nucleocapsid protein based IgM-ELISA for the early detection of distemper infection in dogs[J].Vet Immunol Immunopathol, 2007, 119 (3/4): 278-286.

[24] 李娜. 犬瘟热病毒核蛋白基因的克隆与表达及间接ELISA检测方法的初步建立[D]. 扬州: 扬州大学. 2007.

[25] An D J，Kim T Y，Song D S，et al.An immunochromatography assay for rapid antemortem diagnosis of dogs suspected to have canine distemper [J].J Virol Methods,2008,147(2):244-249.

[26] Gaedke K，Zurbiggen A，Baumgartner W.In vivo and in vitro detection of canine distemper virus nucleoprotein gene with digoxigenin -labelled RNA, double -stranded DNA probes and oligonucleotides by in situ hybridization[J].Journal of Vet Medicine Series B,1997,44(6):329-340.

[27] Stanton J B，Poet S，Frasca S Jr，et al.Development of a seminested reverse transcription polymerase chain reaction assay for the retrospective diagnosis of canine distemper virus infection[J].J Vet Diagn Invest,2002,14(1):47-52.

[28] Saito TB, Alfieri AA, Wosiacki SR, et al. Detection of canine distemper virus by reverse transcriptase-polymerase chain reaction in the urine of dogs with clinical signs of distemper encephalitis[J]. Res Vet Sci. 2006,80(1):116-119.

[29] Cho HS，Park NY. Detection of canine distemper virus in blood samples by reverse transcription loop-mediated isothermal amplific ation[J]. Journal of Vet Medicine Series B, 2005, 52(9): 410-413.

[30] 刘彩玉, 王吉贵, 袁道莉等. 犬瘟热病毒反转录环介导等温扩增诊断方法的建立[J]. 中国兽医科学, 2010, 40(04): 368-372.

[31] Wang F, Yan X, Chai X, et al. Differentiation of canine distemper virus isolates in fur animals from various vaccine strains by reverse transcription-polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism according to phylogenetic relations in china[J].Virol J. 2011 27(8):85-92.

[32] Yi L, Cheng S, Xu H, et al. Development of a combined canine distemper virus specific RT-PCR protocol for the differentiation of infected and vaccinated animals (DIVA) and genetic characterization of the hemagglutinin gene of seven Chinese strains demonstrated in dogs. J Virol Methods. 2012,179(1):281-287.

（2014–06–08）

S852.65+5

B

1007-1733(2014)08-0096-04