日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白重组抗原的制备及其诊断价值的研究

许 进，汪世平，周云飞，金 晶，彭交凤，尹铁球，何 鑫，李 芬,何 军，徐绍锐

血吸虫病在世界范围广泛流行，仍是一种严重危害流行区居民身心健康、阻碍社会经济发展的人兽共患寄生虫病[1]。我国经过几十年的防治取得了举世瞩目的成就。目前，急感疫情主要局限于湖北、湖南、安徽、江西等4省湖区，并处于较低流行态势。但是，常规粪检查病方法的不够敏感。2011年全国居民血吸虫感染时其中93%(54 679/58 840)用免疫学诊断技术，仅有7%(4 161/58 840)用病原学诊断方法[2]，显示免疫学诊断技术在现场应用中扮演非常重要角色。然而，现阶段市场上诊断抗原大多为虫源或卵源性的粗制混合抗原，由于抗原制备难以标化、批间差异大，在现场应用中存在难以克服的技术瓶颈，使其大规模现场应用受到了限制。近几年来，随着分子生物学技术的快速发展，蛋白重组技术使得低成本获得高纯度的单一组分的血吸虫重组抗原成为可能。

业已证明[3-5]，SjSDISP具有较强的免疫原性和免疫反应特性。本文通过构建SjSDISP原核表达质粒，通过诱导表达和纯化，获得较纯的rSjSDISP重组蛋白抗原。以rSjSDISP为诊断抗原建立F-ELISA体系，并对其作出评价；同时与SEA-IHA、SEA-F-ELISA平行检测335份血吸虫病疫区现场人血清，比较分析三者的敏感度与特异度，以期为日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白作为诊断血吸虫病的重组抗原提供依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1主要试剂 酵母提取物(YEAST EXTRACT)、胰蛋白胨(TRYPTONE)为英国OXOID公司生产；琼脂糖(Agarose)为西班牙进口分装(上海Dene Tech公司)产品；限制性内切酶(BamHⅠ，SalⅠ)、DNAMaker、Protien Maker均为Ferments公司产品；质粒小量提取试剂盒(DP103-02)、PCR产物回收试剂盒(DP204-02)为天根生物技术公司产品；日本血吸虫抗体检测试剂盒(间接血凝法)为岳阳迅超生物科技有限公司产品；日本血吸虫病快速诊断试剂盒为湘雅医学院血吸虫病研究室研制，湖南景达生物工程有限公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2实验动物 阳性钉螺为本系钉螺实验基地提供；SPF级新西兰大白兔，雌性，体重1.5 kg～2.5 kg，购自湖南省农业大学动物中心。

1.1.3菌株 菌株E.coliBL21、pET32a(+)、pQE30/SjSDISP为本科室保存菌种。

1.1.4血清 335份现场血吸虫病流行区人血清为本科室所保存，30份健康人血清、18份血吸虫病患者血清(粪便中查到虫卵确诊)、9份卫氏并殖吸虫患者血清(粪便中查到虫卵确诊)、4份肝片吸虫患者血清(粪便中查到虫卵确诊)由本系特检室提供。

1.2方法

1.2.1pET32a/SjSDISP重组质粒的构建及表达

1.2.1.1SjSDISP成熟体基因的PCR扩增 依据SjSDISP目的基因序列和原核表达载体pET32a(+)多克隆酶切位点，设计引物一对(由上海华大基因有限公司合成)。

上游引物P1为：5′-GCGGATCCATGCTGAAGTCTCTATCTAC-3′

BamHⅠ

下游引物F1为：5′-ACGTCGACTCAGTCAGTTCTTGTCTCCG-3′

SalⅠ

以重组质粒pQE30/SjSDISP为模板进行PCR扩增。扩增条件为：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸130 s，共35个循环，72 ℃延伸10 min。

1.2.1.2重组质粒的构建与鉴定 限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ双酶切PCR产物，纯化回收目的片段，亚克隆至载体pET32a (+)，构建重组质粒pET-32a/SjSDISP，转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞中。将阳性单克隆菌液按照快速小量质粒提取试剂盒说明书提取重组质粒，进行BamHΙ、SalΙ双酶切鉴定和DNA测序鉴定(由武汉华大基因有限公司完成测序)。

1.2.1.3pET32a/SjSDISP重组质粒表达条件的优化 遵循单因子变量原则通过对温度、诱导时间、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)终浓度进行一系列的条件模拟，最后用12%SDS-PAGE确定最佳诱导条件。

1.2.1.4重组表达产物的纯化 取菌体裂解上清液，用0.45 μm过滤器过滤。按Ni2+-NTA亲和层析柱说明书过柱纯化上清过滤液，分别进行洗涤和洗脱，分组收集洗涤液和洗脱液，最后用12%SDS-PAGE凝胶电泳，观察纯化结果。

1.2.1.5纯化rSjSDISP重组蛋白抗原的免疫原性鉴定 按照文献[6]报道的方法对rSjSDISP重组抗原进行Western blot免疫原性鉴定。取纯化的rSjSDISP分别与PBS 、1∶2 000的小鼠His-tag 抗体及1∶20的鼠阳性血清、鼠阴性血清反应，以HRP标记的山羊抗小鼠、兔抗体为二抗，进行Western blot分析鉴定。

1.2.2棋盘滴定法确定最佳SjSDISP抗原包被浓度、血清稀释度 取10份健康人血清混合、10份血吸虫病患者血清混合作为参阴、参阳模式血清。通过棋盘滴定法来决定最佳SjSDISP抗原的包被浓度和血清最佳稀释度：将抗原稀释至10 μg/mL-1、5 μg/mL-1、2.5 μg/mL-1、1.5 μg/mL-1、1.0 μg/mL-1，参阳、参阴患者血清分别按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶400稀释度稀释，最后利用酶标仪测定每孔OD450值，计算P/N值。P/N值=(阳性对照孔OD450平均值-空白对照孔450 n均值)/(阴性对照孔OD450均值-空白对照孔OD450均值)。以P/N值最大的反应条件为间接ELISA的最优包被浓度、血清稀释度为判定依据。

1.2.3对rSjSDISP F-ELISA检测日本血吸虫病阳性诊断阈值的确定及该诊断方法的敏感度、特异度、约登指数及诊断效能的检测 rSjSDISP F-ELISA检测30份健康人血清、31份寄生虫病患者血清(其中18份日本血吸虫患者的血清、9份肺吸虫患者血清、4份肝吸虫患者血清)，每份样品设立复孔，结果取其平均值，对其结果进行统计学分析，绘制ROC曲线。根据ROC曲线图得到约登指数最大的切点为最佳临界点，即ROC曲线图横坐标与纵坐标相加为最大值时所对应的点为最佳临界点[7-8]。分析此种诊断方法的敏感度(Se)、特异度(Sp)、阳性似然比、阴性似然比、约登指数(Youden指数)及诊断效能E[9]。

1.2.4rSjSDISP F-ELISA检测不同血吸虫感染时期的兔血清

1.2.4.1早期感染兔血清的制备 取9只健康新西兰大白兔，采用腹部贴片法经腹部皮肤攻击感染500±50尾日本血吸虫尾蚴。分别于感染前1 w、感染后第1 w～5 w，每w自兔耳缘静脉采血5 mL/只(共6组)，分离血清，标记，-20 ℃保存备用。

1.2.4.2rSjSDISP F-ELISA早期诊断价值 取SEA-IHA试剂盒中参阴、参阳兔血清作为rSjSDISP F-ELISA质控对照，与SEA-IHA平行检测6组早期感染兔血清，观察并比较两者的早期诊断结果。

1.2.5比较rSjSDISP F-ELISA、SEA-IHA和SEA F-ELISA 3种方法的敏感度和特异度 取参阴、参阳模式血清做为对照，利用3种方法平行检测335份待测人血清，分析其结果，采用卡方检验(利用SPSS17.0统计分软件)比较3种方法的敏感性和特异性。

2 结 果

2.1pET-32a/SjSDISP重组质粒的构建及表达产物的鉴定

2.1.1SjSDISP原核重组表达质粒的鉴定 对含有单克隆菌的过夜培养液进行菌液PCR，经1%琼脂糖凝胶鉴定显示，在约837 bp处有一清晰条带，与目的基因大小一致；对提取的重组质粒经限制性内切酶BamHⅠ、SalⅠ双酶切后，发现在约5 999 bp、837 bp处有两条条带，而空载体pET32a经相同限制性内切酶双酶切后仅发现一条5 999 bp左右的条带(图1)。测序证明重组质粒构建成功。

2.1.2SjSDISP重组蛋白表达的最优条件 不同诱导条件的SDS-PAGE结果如图2、图3、图4，发现IPTG终浓度为0.1 mmol/L，28 ℃诱导6 h时SjSDISP重组蛋白表达量最大。

2.1.3重组蛋白的纯化 12% SDS-PAGE胶电泳发现rSjSDISP可溶性表达效果良好，洗脱液中条带单一，纯度在95%以上，结果见图5。

图1重组质粒pET32a/SjSDISP双酶切及菌液PCR琼脂糖凝胶电泳分析结果

Fig.1AgarosegelelectrophoresisforidentificationofplasmidpET32a/SjSDISPdigestionwithrestrictionenzymeandPCRamplification

Lane M: DNA marker 1 kb; Lane 1: pET32a plasmid; Lane 2: pET32a digested byBamH I andSalI; Lane 3: pET32a/SjSDISP plasmid;

Lane 4: pET32a/SjSDISP digested byBamH I andSalI; Lane 5: PCR products of pET32a/SjSDISP; Lane M': DNA marker DL2000

图2不同诱导温度对rSjSDISP蛋白表达量影响的SDS-PAGE结果

Fig.2EffectsofvariedinductiontemperatureontheexpressionoftherSjSDISP

Lane 1: pET32a/SjSDISP with IPTG induction at 36℃; Lane 2: pET32a/SjSDISP with IPTG induction at 32 ℃;Lane 3:pET32a/SjSDISP with IPTG induction at 28 ℃; Lane 4: pET32a/SjSDISP with IPTG induction at 24 ℃; Lane 5: pET32a/SjSDISP with IPTG induction at 20 ℃; Lane M: Protein marker;

2.1.4SjSDISP原核重组蛋白的Western-blot免疫原性鉴定 纯化后的SjSDISP重组蛋白不被PBS、山羊抗小鼠二抗、日本血吸虫阴性小鼠血清识别，能特异的被鼠His-tag 抗体、日本血吸虫阳性小鼠血清识别，而且两者所识别的条带大小完全相符(图6)，约在52.0 kDa处，说明SjSDISP重组蛋白表达纯化成功，并且具有很好的免疫原性。

图3不同诱导时间对rSjSDISP蛋白表达量影响的SDS-PAGE结果

Fig.3EffectsofvariedinductiontimeontheexpressionoftherSjSDISP

Lane 1: pET32a/SjSDISP with IPTG induction for 6 hours;Lane 2: pET32a/SjSDISP with IPTG induction for 5 hours;Lane 3: pET32a/SjSDISP with IPTG induction for 4 hours;Lane 4: pET32a/SjSDISP with IPTG induction for 3 hours;Lane 5: pET32a/SjSDISP with IPTG induction for 2 hours.Lane 6: pET32a/SjSDISP with IPTG induction for 1 hours.;Lane M: Protein marker

图4不同IPTG终浓度对rSjSDISP蛋白表达量影响的SDS-PAGE结果

Fig.4TheSDS-PAGEresultofrSjSDISPinducedwithdifferentdoseofIPTG

Lane 1: pET32a/SjSDISP inducted by 0.5 mmol/L IPTG; Lane 2: pET32a/SjSDISP inducted by 0.2 mmol/L IPTG; Lane 3: pET32a/SjSDISP inducted by 0.1 mmol/L IPTG; Lane 4: pET32a/SjSDISP inducted by 0.05 mmol/L IPTG; Lane 5: pET32a/SjSDISP inducted by 0.02 mmol/L IPTG; Lane 6: pET32a/SjSDISP inducted by 0.01 mmol/L IPTG; Lane M: Protein marker.

2.2rSjSDISP抗原快速ELISA的最佳抗原包被浓度、血清稀释度 对棋盘滴定法测定结果(表1)分析发现当rSjSDISP抗原的包被浓度为1.5 μg/mL时，血清稀释度为1∶50时P/N值最大，故选以上条件为抗原最佳包被浓度，待检血清最佳稀释度。

图5重组蛋白rSjSDISP纯化结果

Fig.5PurificationofrecombinatproteinrSjSDISP

Lane 1: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21wash by imidazole buffer of 500 mM; Lane 2: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21wash by imidazole buffer of 250 mM; Lane 3: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21wash by imidazole buffer of 100 mM; Lane 4: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21wash by imidazole buffer of 75 mM ; Lane 5: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21wash by imidazole buffer of 50 mM; Lane 6: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21wash by imidazole buffer of 20 mM; Lane 7: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21 wash through; Lane 8: Supernatant of cell lysate of pET32a/SjSDISPE.coliBL21; Lane M: Protein marker.

图6重组蛋白rSjSDISPWesternblotting抗原性鉴定结果

Fig.6ResultofWesternblottingfortherSjSDISP

Lane M: ProView protein marker; Lane 1: rSjSDISP incubated with rat sera infected by schistcsomiasis; Lane 2: rSjSDISP incubated with normal rat sera; Lane 3: rSjSDISP incubated with anti-His-tag antibody; Lane 4: rSjSDISP incubated with PBS.

2.3日本血吸虫病诊断阈值的确定及诊断实验的评价 经过统计学分析，得ROC曲线(图7)，曲线下的面积为0.970，说明诊断准确度较高。ROC曲线越靠近左上角，曲线下面积越大，诊断效率越高，当OD450nm=0.187时，敏感度为94.4%，特异度为93.0%，为诊断日本血吸虫病的最佳临界值，即当OD450nm≥0.187时可判定为血吸虫阳性血清。

表1 SDISP重组蛋白最佳抗原包被浓度、血清最佳稀释度的选择

图7rSjSDISPF-ELISA检测ROC曲线图

Fig.7DiagramofROCcurveofrSjSDISPF-ELISAexamination

rSjSDISP F-ELISA检测30份健康人血清、31份寄生虫病患者血清结果如表2。rSjSDISP F-ELISA检测确诊血清的敏感度、特异度、约登指数及诊断效能等结果见表3。从以上结果可以看出采用rSjSDISP F-ELISA在检测9份肺吸虫病患者血清时，出现1份假阳性，但是其总的特异度达到了93.0%，说明此种诊断方法特异性尚可。rSjSDISP F-ELISA阳性似然比为13.6，说明rSjSDISP F-ELISA检测阳性是粪检阳性的13.6倍；rSjSDISP F-ELISA阴性似然比为0.054，说明rSjSDISP F-ELISA检测为阴性为来自粪检阴性可能性仅为阳性的0.054倍；在血吸虫病流行率(P)分别为1%、5%、15%的地区，该测试系统诊断符合率的理论预测值分别为0.932，0.931，0.933。

2.4rSjSDISP F-ELISA的最早检测时期 经过rSjSDISP F-ELISA和SEA-IHA平行检测日本血吸虫早期感染的6组兔血清，检测结果见表4。对数据进行卡方检验分析，两种血清学诊断方法检测结果无统计学意义。即两者都在日本血吸虫感染第28 d区别出现阳性反应。SEA-IHA在血吸虫感染后第3 w检测出阳性1例，但无统计学意义。

表2 rSjSDISP F-ELISA检测结果

2.5rSjSDISP F-ELISA与SEA-IHA、SEA F-ELISA 3种方法检测结果比较 用rSjSDISP F-ELISA、SEA-IHA和SEA F-ELISA 3种方法检测335份待测人血清，检测结果如表5、6。对表5、6数据进行卡方检验分析发现，按α=0.05水准，P值分别为0.741、0.657都远大于检验水准0.05，可认为rSjSDISP F-ELISA与SEA-IHA两种诊断方法所检测的结果无显著性差异；重组抗原rSjSDISP与虫卵可溶性抗原SEA所检测结果的差异无统计学意义。

3 讨 论

目前，我国血吸虫病流行已处于较低水平的态势，导致现有检测方法难以快速确诊的原因之一[10-11]。因此，探讨提高检测敏感性为导向的低度流行区检测技术与方法，成为我国血吸虫病诊断研究的重点[12]。常规改良加藤氏粪检方法在低流行区漏检率高，尤其对轻度慢性感染者、晚期患者等，难以查出病原体而易致漏诊，人为地造成对疫情的低估，增加了对传播控制地区和传播阻断地区输入性传染源的监测难度。传统的血清免疫学检测方法，多基于混合的虫卵可溶性抗原，成分复杂，常常影响检测的特异性，结果重复性较差；而且抗原制备周期长、制备成本高，难以批量化生产，以致难以满足现场的大规模应用。随着基因克隆技术的不断完善与成熟，利用基因重组技术制备重组抗原，不但可以满足现场推广应用所需的大量抗原材料，而且弥补了粗抗原制作及应用过程中的诸多不足。重组抗原制备简单易行，且成本低、使用安全、重复性好。日本血吸虫琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白(SjSDISP)存在于血吸虫生活史各期，广泛分布在日本血吸虫童虫、成虫的体壁上，可诱导机体产生高滴度抗体，且对动物具有较好的免疫效果[13]。本文通过对SjSDISP原核重组蛋白进行Western blot免疫原性鉴定发现纯化后的SjSDISP重组蛋白能特异性识别日本血吸虫感染鼠血清，说明其具有成为诊断候选抗原的潜在价值。

表3 rSjSDISP F-ELISA检测结果的Youden指数、似然比及诊断效能

表4rSjSDISPF-ELISA与SEA-IHA检测五组不同日本血吸虫感染时期兔血清结果

Tab.4ResultoftherSjSDISPF-ELISAandIHAinthedetectionoffivegroupsofrabbitserumindifferentinfectedperiodsbyschistosomiasis

TimeSjSDISP F-ELISASEA-IHAPositive countsNegative countsPositive countsNegative countsThe first week before infection0909The first week after infection0909The second week after infection0909The third week after infection0918The forth week after infection9090The fifth week after infection8190

表5rSjSDISP与SEA抗原的敏感性与特异性的比较

Tab.5ComparisononthedetectionresultofF-ELISAusingrSjSDISPandSEAascoatingantigen

SjSDISP F-ELISASEA F-ELISAPositive countsNegative countsTotalPositive counts17038208Negative counts4384127Total213122335

表6SjSDISPF-ELISA与SEA-IHA检测结果的比较

Tab.6ComparisononthedetectionresultofF-ELISAusingrSjSDISPandIHA

rSjSDISP F-ELISASEA-IHAPositive countsNegative countsTotal Positive counts17543218Negative counts3978117Total214121335

本实验通过对SjSDISP快速ELISA与SEA-IHA检测结果进行统计学分析发现，两者之间的差异没有统计学意义。同时，本实验还比较了以重组抗原SjSDISP为包被抗原和以SEA为包被抗原的ELISA所诊断的结果，发现其统计学结果显示差异无统计学意义说明rSjSDISP具有与SEA抗原相似的敏感度和特异度。血吸虫早期感染兔血清的检测结果，证明rSjSDISP F-ELISA与SEA-IHA都可在尾蚴感染新西兰兔后第28 d检出相应抗体，说明rSjSDISP与SEA在早期诊断方面也具有相似的诊断价值，均较粪检虫卵的时间提前了1 w以上。但是，rSjSDISP原核融合蛋白是基因工程重组蛋白分子，容易大量制备，成本低廉。研究结果显示，重组抗原SjSDISP可作为可溶性虫卵抗原SEA的替代抗原，对血吸虫病具有较好的诊断价值。但是，9例肺吸虫病人中出现1例阳性反应，有关重组抗原SjSDISP与其他寄生虫病方面的交叉反应问题，还有待进一步扩大样本后的深入研究。

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