Real-Time PCR检测棘阿米巴方法建立及应用

秦 茜，谷 禾，梁韶晖，韩真真，郑善子

棘阿米巴(Acanthamoeba)是棘阿米巴角膜炎和阿米巴性肉芽肿性脑炎的病原体，目前报告能够引起人类致病的至少有27种[1]，其中有10种能引起人或动物机会性致病。自1973年Jones等报道了世界上首例棘阿米巴性角膜炎病例[2]以后，1992年金秀英等报告我国首例棘阿米巴性角膜炎病[3]。棘阿米巴角膜炎(Acanthamoeba keratitis，AK)是一种致盲率极高，顽固性、进行性角膜炎。近20年来，AK发病率的升高与隐形眼镜(Contact lens，CL)及软性角膜接触镜(Soft contact lens，SCL)用于纠正视力的治疗及普及密切相关。1994～2012年全国棘阿米巴207例病例报道中[4-22]发现，因佩戴隐形眼镜导致的AK占12%～78%[4-6,11,13,16]。棘阿米巴角膜炎发病早期常缺乏特异性临床表现，常因漏诊、误诊而延误治疗引起致盲，故其诊断和治疗仍然是棘手的问题。诊断技术，尤其是早期诊断技术的研究及应用对于阻止棘阿米巴感染人眼引起角膜致盲起着举足轻重的作用。本研究在课题组研究基础上[23-24]进一步研究建立了无创，更为经济适用，灵敏度高的TaqMan探针实时荧光定量PCR(Real-time PCR，又缩写为qPCR)基因检测法测定棘阿米巴的18sDNA，并运用建立的方法对临床疑似样本进行检测，为临床无创性早期诊断该病原奠定研究基础。

1 材料与方法

1．1样本及基因测序 4株土壤中分离的棘阿米巴CB/S1(T5型)，CG/S1(T4型)，CJY/S1(T4型)

CJY/S2(T4型)和1株水中分离的棘阿米巴CJY/S2(T4型)样本及基因测序由延边大学提供，根据郑善子等[25]建立的分离及培养棘阿米巴的实验方法进行保种和传代。同时选用温州医科大学微生物教研室提供的大肠杆菌，人巨细胞病毒和寄生虫学教研室提供的卡式肺孢子虫以及根据朱学军[26]等报道由本科组建立的兔棘阿米巴角膜炎模型眼分泌物和由温州医科大学附属二院眼科、附属眼视光医院提供的疑似病人眼分泌物160例，作为对照样品及方法应用验证。用传统实验室虫株培养法对病例样本培养作为qPCR检测方法对照。

1．2DNA提取 取培养液标本500 μL，12 000 r/min离心10 min, 弃上清，在沉淀中加入50 μL抽提裂解液混匀(10 mmol/L Tri-HCl，pH 7.6, 5 mmol/L EDTA， 0.5%SDS)置100 ℃煮沸10 min, 12 000 r/min离心5 min，取2 μL上清液作为PCR模板。

1．3qPCR反应 运用Bio edit软件对测序样本进行基因比对后，在棘阿米巴物种保守序列区设计引物和探针序列(上海生工合成)。引物序列为Forward: 5′-TATGGTCGCAAGGCTGAAACT-3′，Reverse：5′-GAGCTATCAATCTGTCAATCCT-3′。探针序列为5′FAM-ACCTGGTAAGTTTCCCCGTGTTG-BHQ1-3′。qPCR反应体系25 μL，各引物和探针浓度分别为0.4 μmol/L和0.2 μmol/L，TaqMan探针需要高效液相 (HPLC)纯化，反应体系包括2×荧光定量PCR 缓冲液(其中包括dNTP、MgCl2和热启动Taq酶等)12.5 μL，引物0.25 μL，探针0.1 μL，模板2 μL。qPCR反应体系由大连宝生物工程有限公司提供(TAKARA)。反应条件为94℃预变性2 min后，94 ℃ 15 s，62 ℃ 60 s为一个循环，共循环40次(ABI 7500检测仪上检测)。每份样本重复检测3次筛选出重复稳定性强的棘阿米巴株由上海英潍捷基贸易有限公司(Invirogen)构建T载体克隆阳性质粒，并测序。以该棘阿米巴菌株原液和稀释10倍、102倍、103倍样本建立qPCR检测棘阿米巴标准曲线。

1．4数据分析 分别运用JMP5.0.1中F检验方差分析和诊断测试评估软件评估160疑似棘阿米巴角膜炎病例阳性感染率和比较qPCR检测法与传统培养法95%置信区间内灵敏度和特异性。用30例正常人眼分泌物，家兔棘阿米巴模型眼分泌物，5株实验室分离培养不同基因型棘阿米巴及其他病原微生物作为对照。

2 结 果

2.1实验室培养法和qPCR法测定棘阿米巴样本结果 两种方法测定棘阿米巴角膜炎疑似病例结果见表1,测定的CT值22.01，160例疑似棘阿米巴角膜炎病人眼分泌物中，用培养法测出5例阳性，阳性率为3.31%，其中3例有佩戴隐形眼镜。用qPCR法测出6例阳性，包含培养法测定的5例阳性，阳性率为3.75%，见表2，其中有4例患者佩戴隐形眼镜。用Jmp5.0.1分析软件F方差分析比较培养法阳性率(3.13%)和 qPCR法测定阳性率(3.75%)，其F= 0.6189,P=0.4614>0.05, 故没有明显差别。正常人眼分泌物30例、大肠杆菌、人巨细胞病毒和卡式肺孢子虫，用qPCR检测发现与实验室分离培养株、兔棘阿米巴模型眼分泌物没有交叉反应，检测结果均为阴性。qPCR测定棘阿米巴阳性结果与阴性结果分别见图1,2。根据样本分子量=碱基数×324，待测样本拷贝数(copies/μL)=待测样本浓度/样本分子量×6×1014计算公式，经过重复性实验发现在10拷贝/mL时的重复性为100%，而低于10拷贝之后，检测的重复性不是太稳定，所以定10拷贝/mL为最低检测浓度。

2.2qPCR测定棘阿米巴标准曲线 用qPCR测定棘阿米巴四种稀释浓度结果见图3，T载体克隆阳性质粒测序后BLAST得知该菌株为为T4型，约130 bp扩增片段。以该4个浓度滴度作为检验该荧光定量PCR的相关性分析，发现该4个浓度的荧光定量PCR扩增曲线CT值与浓度对数成线性关系，因此我们以CT值为纵坐标(Y)，以样本浓度对数为横坐标(X)建立了标准曲线,见图4：Y=-3.24 X+40.74，R>0.99。

图1 qPCR测定棘阿米巴阳性结果

图2 qPCR测定棘阿米巴阴性结果

样 本Sample数量No.培养 Culture阳性阴性PosNegqPCR阳性阴性PosNeg温州医科大学眼视光医院疑似病例Sample 180278278温州医科大学附属二院眼科疑似病例Sample 280377476正常人眼分泌物Normal30030030样 本Sample数量No.培养检测 Culture阳性阴性PosNegqPCR阳性阴性PosNeg实验室分离培养株Culture in Lab55050家兔动物模型眼分泌物Animal model eye secession33030大肠杆菌、人巨细胞病毒和卡式肺孢子虫Other pathogen30303

图3棘米巴原液和稀释101倍、102倍、103倍样本qPCR检测结果

Fig.3ResultsofqPCRtestsampleanddiluteto101,102,and103samples

2.3qPCR法与传统培养法测定比较 用诊断测试评估软件测定表1中两种方法显示检测结果数据后得出两种方法的阳性率，灵敏度，特异性，阳性预先值和阴性预测值见表2。培养法灵敏度为83.33%,95%置信区间为36.10%～97.24%，特异性为100%，95%置信区间为99.61%～100%，阳性预先值为100，95%置信区间为47.95%～100%。qPCR法灵敏度为100,95%置信区间为47.95%～100%，特异性为99.35，95%置信区间为96.44%～99.89%，阳性预先值为83.33%，95%置信区间为36.10%～97.24%。

图4用棘米巴原液和稀释10倍、102倍、103倍样本建立qPCR测定棘阿米巴标准曲线图

Fig.4StandardcurvesofestablishedqPCRmethodtestsampleand101,102,and103samples

表2PCR法与传统培养法对160例棘阿米巴角膜炎疑似病例灵敏度及特异性的比较

Tab.2ComparisonofsensibilityandspecificityforcultureandqPCRmethodinthediagnosisofsuspectedAcanthamoebakeratitiscases

检测方法(Method)阳性(Pos)阳性率%(Posrate %)培养(+)QPCR(-)C PosQPCR Neg培养(-)QPCR(+)C NegQPCR Pos培养(-)QPCR(-)C NegQPCR Pos灵敏度%Sensitivity%特异性%Specificity%阳性的预先值%PPV%阴性的预先值%NPV%培养Culture53.13qPCR63.75∗0130983.33(36.10～97.24)100(99.61～100)100(47.95～100)99.35(96.44～99.89)100(47.95～100)99.35(96.44～99.89)83.33(36.10～97.24)100(97.61～100)

注: F检验方差分析两种方法检测棘阿米巴角膜炎疑似病例阳性率比较结果F=0.6189,P=0.4614>0.05, 故没有明显差别。

诊断测试评估两种方法的灵敏度与特异性测定均在95%置信区间内。

Note: Pos=Positive; Neg=Negative; PPV=Positive predictive value; NPV=Negative predictive value.

F=0.6189,P=0.4614>0.05, which is no significant difference (95% CI).

3 讨 论

棘阿米巴角膜炎是致盲率极高的慢性进行性角膜炎。棘阿米巴的繁殖速度极快，感染包囊3 d内可转变为滋养体，且包囊不易被杀灭，故该病治疗预后极差。AK患者在早期多以单眼畏光、流泪和疼痛为主诉，常缺乏特异性，国内缺乏早期高效、灵敏的诊断技术的研究、推广和应用，因此常导致误诊、漏诊、误治。随着分子生物学的发展，无创伤性、灵敏度高、特异性强的 PCR技术逐渐取代了角膜刮片中寻找病原检查。本课题组经过近7年研究，致力寻找经济适用，高效灵敏的早期诊断技术，本文通过对临床疑似病例检测比较，Real-time PCR又名为qPCR技术灵敏度(100)高于传统的实验室培养检测技术(灵敏度为83.33)。经过反复验证，该方法检测结果重复性高，从标准曲线中也可看出不同稀释浓度样品相关性较好，R值达到0.99以上，从标准曲线中得知qPCR测定棘阿米巴CT值与样本浓度的对数成反比，样品10拷贝/mL为最低检测浓度。通过qPCR技术对正常眼分泌物、细菌、病毒、其他寄生虫与实验培养株、动物模型检测比较，进一步验证了该方法的特异性和准确性。qPCR技术应用在检测棘阿米巴角膜炎上具有无创，经济，高效，灵敏，准确，特异性强等优点。

引起AK的病因有很多，但从已有的报道来看，多数与隐形眼镜及软性角膜接触镜矫正屈光不正在我国的普遍使用有密切关系。棘阿米巴的病例由20年前的10余发展到现在的207例，其中因CL和SCL引起的病例国内达到45%[4-6,11,13,16]，国外从30%～40%上升到现在的70%左右。根据18s rDNA(Rns)基因分型结果，感染人类角膜的棘阿米巴多属于Rns T4型，少数属于Rns T3和T6型。此外，污染的隐形眼镜护理液，泥土，脏水，外伤及手术后感染等也是引发感染的因素，其中仅次与角膜接触镜的原因主要为外伤(10%～40%)[6,11,16]引起的感染。

与其他PCR检测技术相比，qPCR技术比起RT-PCR技术更为经济适用，因为它可以不需要逆转录，节约实验成本。比普通PCR更直观看出感染浓度，比复合PCR更稳定，重复性更高。

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