奶粉中蛋白质检测方法的研究*

汪菊付大友 徐晨曦

（四川理工学院材料与化学工程学院，四川自贡643000）

奶粉中蛋白质检测方法的研究*

汪菊**付大友 徐晨曦

（四川理工学院材料与化学工程学院，四川自贡643000）

蛋白质是奶粉的主要成分，也是奶粉质量评价的重要指标之一。综述了奶粉中蛋白质检测方法，包括凯氏定氮法、紫外可见分光光度法、近红外光谱法等，并对这些检测方法的原理、优缺点等进行介绍，为奶粉中蛋白质检测方法的选择及改进提供理论依据。

奶粉；蛋白质；检测方法

近年来，虽然液态奶得到迅速发展，但由于奶粉的功能及其配方具有独特的特点，至今仍然是人们热爱的食品之一。评价奶粉营养价值和质量的首要指标就是蛋白质的含量高低。人类生命活动的基础物质是蛋白质，它是人类最重要的营养物质之一，也是构成人体新生组织、维持人体健康的主要成分，它还具有许许多多生物学功能：酶的催化作用；激素的生理调节作用；血红蛋白的运载作用；肌纤凝蛋白的收缩作用；机体的免疫作用和胶原蛋白的支架作用等，给人们提供了很多信息。

目前市场上劣质奶粉给人们身体健康带来巨大的伤害，此问题也引起相关政府部门的高度重视。如果长期食用劣质奶粉会导致营养不良、免疫力下降，会引发多种疾病从而导致死亡。因此，寻找一种快速、简单地检测奶粉中蛋白质的质量方法是十分重要的。

1 研究方法

奶粉中蛋白质的量是衡量奶粉质量的重要指标之一，也是国家要求各企业必须提供的值。目前测定奶粉中蛋白质的方法有以下几种：国家标准检测方法凯氏（Kiel Dahl）定氮法、紫外吸收法、双缩脲法（Biuret法）、福林-酚试剂法（Lowry法）、考马斯亮蓝法（Bradford法）、近红外光谱法（NIRS法）等。

1.1 凯氏定氮法

国内外检测奶粉中蛋白质含量经典的分析方法是凯氏定氮法，它的应用较为普遍，主要分为消化、蒸馏、吸收和滴定4个阶段，其中消化过程所需时间过长。Domini等采用微波和超声辅助消化，其中经典凯氏定氮法消化时间为30 min、超声辅助用时25 min、微波-超声辅助用时7 min。凯氏定氮法的工作原理是在催化剂的作用下，浓硫酸破坏样品中有机物，将其有机氮全部转化为氨，再与硫酸反应生成硫酸铵，然后加入强碱进行蒸馏使氨逸出，用硼酸吸收，盐酸滴定，测定出含氮量，最后乘以换算系数，计算出蛋白质的含量。此方法分为常量凯氏定氮法、微量凯氏定氮法及改良凯氏定氮法（催化剂中增加Ti02）。

凯氏定氮法对检测总有机氮含量较准确，适用范围广泛。但凯氏定氮法操作过程繁琐、操作时间长（长达2 h～4 h）、样品易被损坏，在样品与硫酸共热过程中，有一定的危险性，并且产生大量的有害气体。一些生产商为获取利益，在奶粉生产过程中非法添加三聚氰胺、尿素、化肥、水解蛋白等非蛋白质氮，由于凯氏定氮法测定的是总有机氮含量，不能够区分蛋白质氮和非蛋白质氮，使得食品安全事件屡次发生。

1.2 紫外可见分光光度法

1.2.1 紫外吸收

蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，从而使蛋白质在波长为280 nm处对紫外光有吸收，其吸光度值与蛋白质的含量成正比关系。并且蛋白质溶液在波长为238 nm下所测得的吸光度值与肽键含量也成正比。在一定波长下，蛋白质溶液的吸光度与蛋白质浓度成正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收具有操作简单、灵敏、快速的优点，但是在测定蛋白质的过程中却有大量的干扰物质（如嘌呤、嘧啶及核酸等）存在；溶液的pH对其蛋白质的吸收峰有一定的影响，吸收峰会因pH的改变而变化，此方法最主要目的是对紫外吸收原理及蛋白质的结构特性有一定的了解。

1.2.2 双缩脲法

双缩脲法是测定乳蛋白的另一种方法。在180℃左右将两分子脲进行加热，释放出一分子氨从而获得双缩脲产物。它的原理是在碱性作用下，含有肽键的化合物与硫酸铜中的铜离子结合生成紫红色络合物，称其为双缩脲反应。凡是含有2个酰胺基或2个直接相连的肽键或间隔1个碳原子相连的肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应。由于蛋白质的浓度与紫色络合物颜色的深浅成正比，在波长为540 nm下所测定的吸光度值从而得出蛋白质的含量，而且蛋白质的分子量和氨基酸成分对其无影响。

双缩脲法可将非蛋白质氮和蛋白质氮较好的分离，排除了多种非蛋白质氮（如三聚氰胺）对检测奶粉中蛋白质含量的影响，得到一个较为满意的结果。但是此方法存在一些干扰物质（主要是三羟甲基氨基甲烷）使其灵敏度下降，因而只适合于快速但不精确的蛋白质检测。

1.2.3 福林-酚试剂法

福林-酚试剂法最早是由Lowry确定蛋白质检测的有关操作。此方法中样品的吸光度值依赖于部分氨基酸的浓度和四肽的结合，这是因它们能减少福林-酚试剂的还原性。

福林-酚试剂法的显色原理是以双缩脲法为前提，加入一种加深显色的试剂，即福林-酚试剂，从而使得蛋白质检测的灵敏度提高。显色量增强的原因是：蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基将福林-酚试剂中的磷钼酸盐-磷钨酸盐还原，产生深蓝色混合物——钼蓝和钨蓝。在一定条件下，颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。

此方法优点是比Biuret法的灵敏度高，缺点是必须严格控制操作时间，比较费时；干扰物质（如甘氨酸等）大量存在；标准曲线为不严格直线，专一性差。不同的蛋白质含有不同量的酪氨酸，颜色深浅就会随蛋白质不同而变化。因此，此法普遍只用于检测蛋白质的相对浓度。

在双缩脲反应中产生的干扰离子反应也会对福林-酚反应引起干扰，并且对福林-酚反应影响更大。浓度较低的硫酸钠、硝酸钠、丙酮等溶液对显色无影响，但是这些溶液的浓度较高时，就必须作校正曲线。仅需加入碳酸钠-氢氧化钠溶液就可以显色测定。如果试样的酸性较高，显色较浅，这时就必须提高碳酸钠-氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。

当蛋白质检测过程中，福林-酚试剂加入时要十分小心，因此试剂只能在酸性条件下稳定，但上述还原反应又只能在pH=10的条件下发生，因此将福林-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立刻混匀，为了在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应能够发生。

1.2.4 考马斯亮蓝法

Bradford在1976年建立了考马斯亮蓝法，它是根据染料与蛋白质相结合的原理进行的。此法检测蛋白质有它独特的优点，因而应用较广泛。目前，Bradford法是蛋白质测定方法中灵敏度最高的。

考马斯亮蓝G-250染料存在着棕红色和蓝色两种形式。在酸性条件下，考马斯亮蓝G-250染料通过范德华力与蛋白质相结合，使它的最大吸收峰的波长由465 nm变为595 nm，并且溶液的颜色也由棕红色变为了蓝色。经研究发现，考马斯亮蓝G-250染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。在蛋白质质量浓度在10 μg/mL～1000 μg/mL时，蛋白质和染料结合符合比尔定律，从而得到与其蛋白质结合的含量。

蛋白质与染料结合大约2 min就能反应完全，此反应很快，出现最大光吸收，大约稳定1 h后，蛋白质与染料所形成的复合物发生聚合并沉淀出来。此复合物具有相当高的消光系数，使得在蛋白质检测过程中具有很高的灵敏度。

考马斯亮蓝法优点：①灵敏度高。比福林-酚法的灵敏度约强4倍，且最低蛋白质检测含量可达10 μg。②快速、简便、所需试剂少。大约5 min就能完成一个样品的测定，染料与蛋白质结合大约2 min所形成的化合物显色最稳定，不需要像福林-酚法那么费时和严格地控制时间。③干扰物质少。Anjalie等研究发现考马斯亮蓝法可以很容易、方便地检测出所有食品中的蛋白质含量，在再生乳粉中蛋白质含量检测时，并无三聚氰胺和三聚氰酸的干扰。

考马斯亮蓝法缺点：①考马斯亮蓝法用来检测不同蛋白质含量时有较为明显的偏差，这是因为不同蛋白质中所含的精氨酸和芳香族氨基酸的量不同，在绘制标准曲线时常常选用γ-球蛋白为标准物质，来降低此偏差。②去污剂、Triton X-100、十二烷基磺酸钠（SDS）和氢氧化钠等干扰物对其测定仍有干扰。③在蛋白质浓度较大时，标准曲线趋向于非线性。④在测定的过程中，比色皿壁上避免不了粘有少许的复合物蛋白-染料，但此复合物的吸附量是可以忽略的，试验完毕后可以通过乙醇清洗掉比色皿上的污染物质。

虽然考马斯亮蓝染色法具有灵敏度高、测定快速、简便、干扰物少、也不需要大型仪器设备等优点，但是此方法只适用于准确度要求不高的微量蛋白质检测。

1.3 近红外光谱法

近年来，近红外光谱法的发展迅猛，尤其是在新型定量、定性分析技术上。近红外光谱与有机物中含氢基团（如C-H、O-H、N-H、S-H等）振动的合频与倍频的吸收一致，因而只需扫描试样的近红外光谱就可以很方便地得到试样中有机分子中含氢基团的特征信息。

由于在近红外光谱区中有机物主要为倍频和合频吸收，因此谱峰重叠性严重，此时具有较弱的消光系数。为了解决谱峰重叠与测量信息高背景低强度，后来人们发现了可以使用化学计量的办法进行消除此等问题。在NIR中，由于样品的组成和结构与近红外光谱存在一定的函数关系。然后，通过使用化学计量学方法来确定出此函数关系、校正，就可以根据所测的近红外谱图快速计算出各种数据。

仪器测量信号的数字化与分析过程的绿色化程度不断提高，从而使得此技术具有以下几个方面特点：①分析对象广，所有与含氢基团有关的有机物质都可以用此法进行分析。②吸收强度低，穿透能力强，分析样品的外形要求不高，样品制备也简单。③适用于漫反射技术。④近红外光可以穿透玻璃或石英介质。⑤分析快速、简便，大约1 min就能完成一个样。⑥对样品无损坏和无污染，并且不需要加入任何溶剂。⑦可以检测试样物理信息。⑧重现性好，效率高，该方法的一个最主要特性是它本身的成套性（近红外光谱仪、化学计量学软件和应用模型的三位一体性），该技术的基础和前提是性能好的近红外光谱仪。

当然近红外光谱分析技术也存在着一定的局限性：①首先，近红外光谱分析需要用一个相似的试样建立一个稳定模型才能够快速得到分析结果，但是它需要一定的人力、财力和时间才能完成模型的建立。②在近红外区范围内，物质吸收系数较小，检测限常在100×10-6，因而不适用对痕量物质进行分析。

1.4 其他检测方法

1.4.1 杜马斯定氮法

引起试样的完全裂解并测定燃烧气体中氮含量称为杜马斯定氮法。在高温（900℃）室内燃烧已知量的样品，释放出二氧化碳、水和氮，然后将所释放出来的气体通过特殊的柱子除掉，此时氮则通过另一根柱子分离开来，再使用氦气作为载气的热导检测器进行检测。此方法所需样品的量一般在5 mg～50 mg范围内，测定快速，测定结果也很准确。Hakoda等在实验室进行研究，分别以日本农业标准（JAS）和凯氏定氮法评定燃烧法来测定通心粉制品粗蛋白的重现性，在测试材料上两者的差异是0.10%～0.13%，但JAS的成本远远大于全自动定氮仪。

1.4.2 电泳法

带电粒子在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象称为电泳。电泳法属于物理检测方法，蛋白质的电泳分离是一种重要的生物化学分离纯化技术。唐萍等通过使用毛细管电泳法来检测奶制品中蛋白质含量，将牛奶中α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、α-酷蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白5种蛋白通过柠檬酸体系进行分离，讨论了缓冲液PH值和运行电压对蛋白质分离的影响。此试验证实毛细管电泳法准确、快速、无污染，并且为牛奶的质量监控和奶粉的配方改善作出贡献。

2 小结

奶粉中蛋白质的检测方法有很多种，但准确、快速、灵敏、低成本来检测奶粉中蛋白质的含量问题尚未得到解决。本文充分地总结了奶粉中蛋白质检测方法的相关原理及优缺点，为选择方法时，提供可靠的依据，同时也为今后研究与开发出更可靠、快速、灵敏的蛋白质检测方法提供一定的理论依据。

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Study on determination method ofprotein in milk powder

WANGJu FUDa-you XUChen-xi
（College ofmaterial science and chemical engineering，Sichuan universityofscience and engineering，Sichuan Zigong 643000，China）

Protein is important indicator of evaluation of milk powder.In this paper，it is discussed the detection method of protein in milk powder，the common detection methods included Kiel Dahl method，Bradford method，NIR spectroscopy and so on.The principle，advantages and disadvantages are introduced.These investigations will provide a theoretical reference for improvingand developingmethods ofprotein detection in milk powder.

milk powder；protein；determination methods

TS252.51

A

1673-6044（2014）02-0015-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2014.02.006

四川省教育厅重点项目（NO.13ZA0123）。

**汪菊，女，1989年出生，四川理工学院应用化学专业在读研究生。

2014-01-09

修回日期：2014-01-12