一种乌鳢与斑鳢线粒体PCR-RFLP鉴定方法

董传举张松皓陈坤慈宋迎楠徐鹏孙效文

（1.中国水产科学研究院生物技术研究中心，北京 100141；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；3.中国水产科学院珠江水产研究所，广州 510380）

一种乌鳢与斑鳢线粒体PCR-RFLP鉴定方法

董传举1，2张松皓1陈坤慈3宋迎楠1，2徐鹏1孙效文1

（1.中国水产科学研究院生物技术研究中心，北京 100141；2.上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306；3.中国水产科学院珠江水产研究所，广州 510380）

为了高效的鉴别乌鳢与斑鳢，采用PCR-RFLP技术，对乌鳢与斑鳢开展分子生物学鉴定方法研究。通过比对乌鳢和斑鳢线粒体全序列，发现1处单核苷酸多态性位点，可以明确区分两个物种。利用1对引物对乌鳢与斑鳢线粒体基因组该区域进行PCR扩增，用限制性内切酶EcoR I分别对扩增产物进行酶切，并用1.5%的琼脂糖凝胶检测酶切结果。PCR-RFLP检测结果显示，斑鳢的PCR扩增产物被EcoR I酶切后生成两个不同大小的片段，分别为315 bp和875 bp，乌鳢则保持不变。由此可将乌鳢与斑鳢在酶切图谱上鉴别出来。

乌鳢 斑鳢 线粒体基因组 PCR-RFLP 鉴定

乌鳢（Channa argus），鲈形目（Perciformes）鳢科（Channidae）鳢属（Channa）鱼类，俗称黑鱼，又名北方蛇头鱼、乌鱼、乌棒、蛇头鱼、文鱼和才鱼，是我国特有的名特优淡水鱼类，在我国广泛分布。乌鳢肉质细嫩，口味鲜美，且营养价值颇高，在国内市场广受欢迎，目前在我国被广泛养殖，具有较高的经济价值。斑鳢（C.maculata）与乌鳢同属于鳢科鳢属，从形态学方面与乌鳢类似，从形态学鉴定有时并不一定准确，存在很强的主观因素，尤其是在苗种期或者食品加工处理后的区分和鉴定比较困难。由于消费习惯、养殖环境、营养价值和养殖成本等原因，乌鳢和斑鳢的市场价值具有较大差异。鉴于此，亟须开发出能够快速鉴定乌鳢和斑鳢的分子检测技术，用于市场监管、种质鉴定等用途。

线粒体DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）作为真核细胞的核外遗传因子，复制方式相对比较简单，遵从严格的母系遗传，在世代传递过程中不发生重组现象，并且结构基因排列紧凑，没有间隔序列和内含子，编码效率高于核DNA。mtDNA的进化速率是核DNA的5-10倍，且缺少有效的DNA损伤修复机制，还有突变累加效应［1］。拷贝数量多，很容易从组织中分离纯化。并且基因片段大小适中，种间进化速率较快，对于探索物种系统发育极为有效［2］。mtDNA序列的差异可以表明遗传群体在进化过程中的分离，单倍型频率可以揭示地理种群间的转移［3］。由于线粒体DNA的这些特点，mtDNA序列也更多地用于研究驯养动物的亲缘关系、起源及其多样性，如兔子、猪、山羊、水牛和马等［4-9］。PCR-RFLP技术是最早的分子标记技术之一，指基于限制性内切酶消化不同长度的限制片段的多态现象在mtDNA分析中广泛使用，由于扩增总DNA，所以可以有效避免纯化mtDNA的繁琐步骤，并且可以通过PCR方法很好地控制DNA片段大小，酶切位点数及扩大模板量，适用于微量组织样品的分析。由于该技术结果可靠、准确、具有较高的稳定性，并且检测中仅需要少量的组织材料，所以适用于对物种各个发育阶段的鉴别研究［10］。

鳢科鱼类是一种颇受欢迎的淡水名贵经济鱼类。我国是一个盛产乌鳢的国家，目前对乌鳢已进行了大量的研究，在行为学、光照对其摄食的影响、最适温度、繁殖特性和苗种培育、生活史、组织器官的发生和发育、营养需求、营养价值以及核型分析和杂交育种等各个方面都有所研究［11-21］。而对斑鳢的研究报道相对少得多，仅见人工繁殖和苗种培育、营养需求和营养价值等方面的研究［22，23］。本研究通过对乌鳢与斑鳢的线粒体进行比对分析，找出差异位点，利用PCR-RFLP技术快速鉴定，旨在为琼脂糖凝胶电泳酶切产物快速准确的鉴定乌鳢和斑鳢提供方法。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究利用中国水产科学研究院珠江水产研究所提供的乌鳢和斑鳢，活体剪取尾鳍一小部分放入1.5 mL离心管中，-80℃保存。仪器与试剂：限制性内切酶和PCR试剂均购置于NEB（北京）有限公司，引物由生工生物工程公司合成，其他试剂均为国产分析纯。PCR仪为Applied Biosystem 9700（Life Technologies）。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 分别剪取10尾乌鳢和10尾斑鳢的尾鳍各0.5 g，剪碎，放入1.5 mL离心管中并分别编号：1-10为乌鳢，11-20为斑鳢，应用酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，乙醇沉淀，-20℃贮存备用。

1.2.2 引物设计 根据文献调研和检索GenBank数据库获取了乌鳢和斑鳢的线粒体基因组序列［24，25］，两个基因组序列编号分别为JX978723（乌鳢）和KC310861（斑鳢）。应用MEGA5.1软件［26］对乌鳢和斑鳢线粒体基因组序列进行比对发现，在第3 126 bp位置存在单碱基差异，并且该位点为限制性内切酶EcoR I识别位点。基于此，我们在该位点两侧相对保守区域，利用Primer5.0软件设计引物序列，对包含该单核苷酸多态性位点的线粒体基因组序列区域进行扩增。

1.2.3 线粒体DNA的PCR扩增 提取的线粒体DNA使用设计的引物进行扩增。PCR反应体系为20 μL：0.5 μL 浓度为2 500 U/mL的TaqDNA聚合酶，2 μL 10×PCR缓冲液，3.2 μL浓度为10 pm/μL的dNTPs，1 μL所述基因组DNA，0.5 μL浓度为10 pm/μL的上游引物No.1，0.5 μL浓度为10 pm/μL的下游引物No.2，12.3 μL无菌水。

PCR扩增反应为：94℃预变性 5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，共35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存备用。

1.2.4 限制性内切酶EcoR I的酶切反应 所述酶切反应体系为20 μL：2 μL 上述PCR产物，2 μL 10×酶切缓冲液，1 μL浓度为20 000 U/mL 的EcoR I限制性内切酶，15 μL无菌水，所述酶切反应体系在37℃反应30 min，获得酶切产物。

1.2.5 琼脂糖凝胶电泳 将PCR产物和酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶浓度为1.5%，电泳结束后，用凝胶图像处理系统采集电泳图，收集数据并分析。

2 结果

2.1 序列比对结果和引物设计

应用MEGA5.1软件对乌鳢和斑鳢的线粒体基因组序列进行比对，发现乌鳢与斑鳢的线粒体DNA在第3 126 bp位置存在单核苷酸多态性。而在斑鳢中，该位置位于限制性内切酶EcoR I识别位点区域（第3 122 bp和第3 123 bp碱基之间的磷酸二酯键为限制性内切酶EcoR I酶切位点）；由于单核苷酸多态性位点的差异，乌鳢无限制性内切酶EcoR I酶切位点（图1），故可以通过限制性内切酶EcoR I对上述扩增片段进行酶切，从而对乌鳢与斑鳢进行区分和鉴别。

通过Primer5.0设计引物（表1）进行PCR扩增，可以得到线粒体基因组2 807-3 997 bp之间的区域。该扩增片段位于线粒体DNA的tRNA-Leu和tRNAGln之间，包括部分tRNA-Leu和tRNA-Gln区域以及全部NADH dehydrogenase subunit I区域和tRNAIle区域，酶切位点位于NADH dehydrogenase subunit I上。

2.2 PCR扩增结果

通过上述引物的PCR扩增，乌鳢与斑鳢线粒体DNA均扩增出单一的片段，未发现其片段长度多态性，如图2所示。

2.3 酶切结果分析

限制性内切酶EcoR I酶切结果，如图3所示。

将图2和图3进行比较，可见图2中乌鳢样本（1-10）的条带经过酶切后在图3中（1'-10'）没有发生变化，说明没有发生酶切，图2中斑鳢样本（11-20）的条带位置和数量在图3中（11'-20'）发生了变化，说明发生了酶切反应。上述酶切位点为距离斑鳢扩增多核苷酸序列5'的第315和第316个碱基之间的磷酸二酯键，而所述乌鳢扩增多核苷酸序列5'的第315和第316个碱基之间的磷酸二酯键不会发生酶切。所以通过酶切反应，将斑鳢所述PCR产物（1 190 bp）包含的DNA分子切成了两段

DNA分子，大小分别为315 bp和875 bp（表2）。

3 讨论

基于线粒体序列开发高效准确的分子鉴定方法也广泛应用于对许多水产品易混物种的鉴定中。例如，Aoyama等［27］利用线粒体DNA的PCR-RFLP技术开发了欧洲鳗鲡和亚洲鳗鲡的快速鉴定方法；Karaiskou等［28］利用线粒体DNA的PCR-RFLP技术对竹荚鱼属3个种进行了成功的分子鉴定等；庄怡等［29］利用PCR-RFLP技术对鲫鱼6个不同品系成功的进行鉴定；王淞等［30］对3个长江野生群体以及一个人工繁殖群体，共158尾鲢mtDNA D-loop区段进行PCR-RFLP分析，从而鉴定4个不同群体的差异；吴海防等［31］采用PCR技术对江西瑞昌、湖南长沙、天津宁河3个群体的144尾草鱼线粒体DNA（mtDNA）D-Loop区段的限制性片段长度多态性（RFLP）进行了分析，得出草鱼mtDNA D-Loop区段的遗传多样性较低的结论；文菁等［32］基于570 bp左右的线粒体16S rRNA基因片段，利用3种核酸内切酶（DdeI，HaeIII和StyI）对16种海参PCR产物进行酶切，分别产生10种、5种和5种单倍型，通过单倍型的组合，即能有效区分16种海参的种类。

仅依据形态学鉴定并不能准确区分乌鳢与斑鳢，从而造成相互混杂，直接影响育种效果。乌鳢与斑鳢mtDNA的结构十分简单，并且与其它脊椎动物的线粒体基因基本相同［33］：一个mtDNA控制区（D -Loop区），13个蛋白质基因，其中一个是细胞色素b基因（cyt b）；两个是ATP酶亚基的基因（ATPase6, ATPase 8）；3个是细胞色素氧化酶的基因（CO I、CO II和CO III）；7个是呼吸链NADH脱氢酶亚基的基因（ND1-6和ND4L），有两个rRNA基因，一个是12S rRNA，一个是16S rRNA，22个tRNA基因。因此，本研究利用斑鳢和乌鳢纯种资源，通过线粒体序列的比对分析，发掘斑鳢和乌鳢的特异性多态性标签，开发一种基于PCR-RFLP技术的快速种质鉴别方法。

乌鳢与斑鳢线粒体PCR-RFLP鉴定方法表明：提取待检测样本的DNA，设计一对相同的引物就可以扩增出乌鳢与斑鳢的mtDNA片段，并且根据该区域mtDNA的一个SNP位点的不同，通过限制性内切酶EcoR I进行酶切，由于斑鳢在该区域具有限制性内切酶EcoR I酶切位点，所以酶切后生成特异的两条带；而乌鳢在该区域不具有酶切位点，故酶切后仍为一条带，从而琼脂糖凝胶电泳后便可以把乌鳢与斑鳢鉴别出来。本方法通过PCR扩增片段的限制性酶切，得到的限制性酶切图谱，不但为乌鳢与斑鳢的鉴定提供了分子标记，同时也为进一步构建物理图谱，进化遗传学和育种研究打下了基础；更有利于实际生产部门，科研部门快速鉴定所取样本，提高了工作效率。

该方法不仅操作简单，而且在保证鱼种存活基础上只需剪取少量鳍条，或者采集少许冷冻鱼肉或鱼糜提取DNA，便可快速准确的鉴别出乌鳢和斑鳢，鉴定结果准确可靠，在群体遗传学、分子生态学和水产品质量鉴定等方面均有较大的应用前景。

4 结论

本研究利用乌鳢和斑鳢线粒体之间的差异，设计引物对包含该差异位点的区域进行扩增。对扩增片段应用限制性内切酶EcoR I酶切，并对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果中，电泳条带为一条的为乌鳢，两条的为斑鳢。根据条带的数量，便可以鉴定出乌鳢与斑鳢。

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（责任编辑 狄艳红）

A PCR-RFLP Method for Channa argus and Channa maculate Discrimination

Dong Chuanju1，2Zhang Songhao1Chen Kunci3Song Yingnan1，2Xu Peng1Sun Xiaowen1
（1. The Centre for Applied Aquatic Genomics，Chinese Academy of Fishery Sciences，Beijing 100141；2. College of Life Science and Technology，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306；3. Pearl River Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Guangzhou 510380）

In order to identificate Channa argus and C. maculate efficiently. We developed a PCR-RFLP method to conduct research in molecular biology. Briefly, two genomes of C. argus and C. maculate were aligned and compared, a SNP was identified which can discriminate two Channa species. A pair of primers was designed to amplify the mitochondrial DNA of both species, then digested by restriction enzyme EcoR I and test the digestion result by agarose gel of 1.5%. The result showed that the PCR product of C. maculate was digested by EcoR I that generate two fragments of 315 bp and 875 bp, while the PCR product of C. argus can not be digested by EcoR I. Thus, two Channa species were clearly discriminated.

Channa argus Channa maculate mtDNA PCR-RFLP Identification

2014-01-03

国家“863计划”项目（2011AA100401），农业部公益性行业科研专项项目（200903045）

董传举，男，博士研究生，研究方向：水产基因组学；E-mail：cjd1989@126.com

徐鹏，男，研究员，研究方向：水产基因组学；E-mail：xupeng@cafs.ac.cn