基因治疗与眼部纤维化疾病

陈向武，赵颖熙

(浙江大学 医学院 附属义乌医院 眼科， 浙江 义乌 322000)

短篇综述

基因治疗与眼部纤维化疾病

陈向武，赵颖熙*

(浙江大学 医学院 附属义乌医院 眼科， 浙江 义乌 322000)

眼球是最适合进行基因治疗的器官之一。随着转化生长因子-β信号通路的认识及miRNA、RNAi等技术的进步，使得基因治疗在眼部纤维性疾病的应用中更具潜力。目前多种眼部纤维化疾病的基因治疗研究进展迅速，但仍面临较多亟待解决的问题。

基因治疗;眼部纤维化疾病;转化生长因子-β;微小RNA;RNA干扰

基因治疗简而言之就是用基因来治疗各种疾病。即通过载体(如病毒或粒子)将遗传物质引入人体细胞使其发挥改建、修饰、补充、封闭、对抗及杀伤等生物学效应以治疗疾病的技术方法，在许多疾病的预防和治疗中已显示出良好的发展前景[1]。眼部纤维化疾病如角膜的瘢痕化、原发性开角型青光眼与滤过性术后结膜的瘢痕化、后发性白内障及增殖性玻璃体视网膜病变等由于病因复杂，常规的药物、手术或激光等治疗方法效果往往不令人满意。随着近年来众多纤维化相关基因的发现，基因治疗在眼部纤维化疾病的研究中取得了长足的进展。本文就基因治疗在眼部应用的优势、眼部纤维化疾病基因治疗的靶点选择及基因治疗在纤维化眼病中的研究进展做一综述，从而为纤维化眼病的防治提供新的思路。

1 眼部基因治疗的优势

眼球因其独特的解剖及生物学特性，而成为最适合进行基因治疗的器官[2]。首先，眼球是由多个小的分隔独立的腔室(如前房、玻璃体腔及视网膜下腔等)构成。这就为病毒载体选择性感染不同眼部结构提供了可能；另外得益于该解剖结构，眼内只要注入少量的病毒溶液，就可在治疗部位长时间维持高浓度的病毒载体，而全身发生毒性反应及病毒扩散的风险微乎其微。第二，眼内的绝大多数细胞不会发生有丝分裂 (极少部分细胞除外如神经胶质细胞)[3]。这既降低了基因治疗过程中眼内细胞发生恶变的风险，又同时保证了新转入的基因在眼内的持续表达，而不受细胞分裂的影响。第三，眼球因其光学通透性而成为体内唯一通过非创技术就可直接观察到血管、神经及其他内部结构的器官。再结合眼底照相、眼底荧光造影及光学相干断层扫描等检查手段，可对基因治疗的过程与结果进行有效地观察和评估。第四，眼球由于血-眼屏障的存在而具有免疫赦免的特性，即眼前房、玻璃体腔、视网膜下腔和角膜基质层对外来抗原的相对无反应状态[4]，这使得眼球针对基因产物和载体抗原的免疫应答反应明显减轻，从而更有利于基因治疗的进行。第五，目前许多关于眼部疾病的动物模型已经制作成功[5]，这为基因治疗的动物实验研究及临床前治疗效果的评估提供了可能。最后，未经处理的对侧眼在基因治疗的过程中具有重要的对照价值。

2 眼纤维化疾病基因治疗的靶点选择

2.1 转化生长因子-β及信号传导通路

转化生长因子-β(transforming growth factor beta，TGF-β)是已知的众多生长因子中与瘢痕形成关系最为密切的一种生长因子[1, 6- 9]。其对炎性细胞和成纤维细胞具有很强的趋化作用，可刺激成纤维细胞产生胶原，并促进间充质细胞分泌各种细胞外基质。因此任何干扰TGF-β的表达及其信号传导通路的因素均可能抑制器官纤维化的发生发展。

TGF-β的信号传导通路有两条：即Smad信号通路和非Smad信号通路[6]。所谓Smad蛋白，即TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用的一类信号传导因子。根据其结构和功能分成3类：R-Smads、Co-Smads及I-Smads。R-Smad亚族包括Smad 1、2、3、5和8。Co-Smad在哺乳类动物中目前只发现一种，即Smad 4。Ⅰ-Smad亚族包括Smad6和7。目前已基本清楚TGF-β激活Smads经典信号传导通路过程：首先TGF-β活化后与Ⅱ型TGF-β受体结合形成复合物，进而使Ⅰ型TGF-β受体活化具备激酶活性，活化的Ⅰ型TGF-β受体再磷酸化下游Smad2和Smad3的氨基残基，使Smad2、Smad3活化并同Smad4形成三聚体，然后易位至细胞核，从而调节靶基因的转录应答。需要注意的是， Smad 7在TGF-β的刺激下会与R-Smad竞争结合TGF-β的Ⅰ型受体。由于Smad 7稳定性强于R-Smad，因此Smad7对TGF-β/Smad信号通路具有抑制作用。

此外，TGF-β还可通过激活如丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase，P13K)、Rho/Roch等非Smad信号通路而发挥信号传导作用[7- 9]。这些途径不但受TGF-β调节，还可受到其他因子的调控[10]。

2.2微RNA(microRNA，miRNA)与RNA干扰(RNAinterference,RNAi)

近年来随着microRNA与RNAi技术的发展，为纤维化疾病的基因治疗靶点选择提供了新的思路与手段。

所谓microRNA是一种21- 25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，通过特异性结合目的RNA的3,端非编码区，在转录后水平和翻译水平调控靶基因的表达，而发挥在细胞内干扰RNA的作用。microRNA通过与目的mRNA的互补结合，直接或间接调控着90%以上人类基因的表达。目前发现特定microRNA能够干扰TGF-β的表达及其信号传导通路而发挥抗纤维化作用[11]。

RNAi是指通过正、反义RNA片段形成双链RNA,从而特异性地抑制靶基因的转录后表达的现象。而干扰性小RNA(small interfering RNA, siRNA) 是RNA 干扰作用赖以发生的重要中间效应分子。已经有研究人员通过RNAi干扰TGF-β信号传导通路来治疗组织器官的纤维化，得到满意的抗纤维化效果[12]。但由于RNAi技术的复杂性及抑制效应的不确定性，还需要进一步的研究。

3 纤维化眼病中基因治疗的研究进展

3.1 角膜的瘢痕化

角膜中TGF-β升高会导致多种细胞因子合成，使角膜基质细胞活化、增殖并合成大量的细胞外基质，导致大量排列混乱的胶原沉积，从而形成角膜基质瘢痕[13]。因此抑制TGF-β信号通路是目前抗角膜纤维化研究的热点。

有研究将携带Smad7 cDNA的腺病毒导入角膜碱烧伤小鼠模型的角膜组织中，发现实验组成肌纤维细胞、巨噬细胞及生长因子的含量均较对照组减少，并且角膜的瘢痕与新生血管的生成亦较对照组减轻[14]。这说明干扰TGF-β信号通路抑制角膜纤维化是可行的。并且通过角膜烧伤模型还发现增加Smad7比抑制Smad3的抗纤维化作用更加明显[12, 14]。那么TGF-β信号通路中哪个位点是抗纤维化效果最好的靶点？目前尚不明确，还需要进一步的研究。

另外近年在角膜烧伤的动物模型中，发现导入microRNA-133b基因的角膜组织中TGF-β表达量明显下降，角膜纤维化也明显抑制[15]。由于microRNA具有无毒及定点调节靶基因表达等优势，为未来基因治疗角膜疤痕的提供更大的潜能。

3.2原发性开角型青光眼及滤过性术后结膜的瘢痕化

研究表明大部分原发性开角型青光眼患者眼内小梁网邻管区的细胞存在纤维增生及玻璃样变等病理改变，这是导致眼压升高和视神经损害的主要原因[16]。这其中TGBβ扮演了重要的角色。有研究将携带Smad7 siRNA的载体导入体外培养的人小梁网细胞中使Smad7 mRNA沉默，发现TGBβ的作用加强，细胞外基质的合成和细胞转化均提高[17]。提示Smad7蛋白具有抑制原发性开角型青光眼的作用。

另外在青光眼滤过性手术中，Tenon’s囊纤维化是导致手术失败的主要原因[18]。已知microRNA-29b的靶基因表达Ⅰ型胶原α链，Ⅲ型胶原蛋白α1链，Ⅳ型胶原蛋白α1链，Ⅴ型胶原蛋白α1链和α2链等一系列胶原蛋白。那么microRNA-29b是否对Tenon’s囊的纤维化过程具有调节作用？有实验对此进行验证，发现人眼球结膜细胞中过量的microR-29b表达能够有效抑制Tenon’s囊的纤维化[19]，但该实验细胞采用体外培养与术后结膜细胞生长环境不同，还无法确定在人体中microR-29b是否具有同样的抗纤维化效果。

3.3 后发性白内障

白内障术后囊袋内残留或新生的上皮细胞增殖所导致的纤维增生是后发性白内障的主要原因。TGBβ/smad信号通路亦在其中起着重要作用。其中Smad3是TGF-β信号通路的一个关键位点，通过阻断TGF-β/ Smad3信号传导通路可以有效抑制白内障术后后囊膜的混浊[20]。很多的实验结果支持上述的观点。如将晶状体前囊膜外伤模型小鼠的Smad3基因敲除，发现该小鼠受损晶体的纤维化受到了抑制[21]。而将携带Smad7的腺病毒导入上述模型小鼠眼内来竞争性对抗Smad3的功能，发现小鼠晶状体上皮细胞内TGF-β、α-平滑肌纤维、蛋白多糖及Ⅵ型胶原蛋白均明显减少，晶状体前囊膜创口处纤维化明显被抑制[22]。

3.4增殖性玻璃体视网膜病变(proliferativevitreoretinopathy，PVR)

PVR是指玻璃体后部和视网膜表面广泛的纤维增殖膜收缩、牵拉并最终引起视网膜脱离的疾病。在PVR过程中有多种细胞参与，但视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，RPE)扮演着最重要的角色。但该细胞通过何种机制参与PVR的形成目前尚不清楚。有研究将携带Smad7基因的腺病毒导入PVR模型小鼠的RPE细胞内干扰其TGF-β信号通路，发现小鼠RPE细胞中Ⅰ型胶原明显下降伴眼内PVR明显抑制[23]。提示RPE细胞可通过TGF-β信号通路参与PVR的形成。最近将以肝细胞因子受体为靶向的siRNA与microRNA-34a分别导入体外培养的人RPE细胞，发现RPE细胞内与迁移、增殖相关的细胞因子如CDK2、CDK4、CDK及E2F1等均表达下降，证明该microRNA及siRNA对RPE细胞的迁移增殖功能具有抑制作用[24]，提示两者也参与调节PVR的形成过程，这为PVR的防治提供了新的思路。

4 总结

虽然基因治疗在眼部纤维化疾病中的研究发展迅速，但仍面临许多亟待解决的问题：1)目前眼部纤维化疾病基因治疗的研究多为离体细胞实验或动物实验，若进一步明确其安全性和时效性等问题，则基因治疗在临床上的应用将获得突破性进展。2)需进一步阐明纤维化疾病的分子生物学发病机制，为基因治疗提供基础。3)需构建更多可供选择的目的基因，促进基因治疗发展。4)需加大对外源性基因导入体内后的可调控性研究，以保障基因治疗取得理想效果。虽然基因治疗在眼部纤维性疾病中的临床应用还只处于初级阶段，但随着基因工程技术的发展，将加快眼部纤维化疾病基因治疗的临床应用，并将开创基因治疗眼部纤维化疾病的新时代。

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Gene therapy and ocular fibrotic disorders

CHEN Xiang-wu, ZHAO Ying-xi*

(Dept. of Ophthalmology, Yiwu Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine, Yiwu 322000, China)

Eye is one of the best target organs for gene therapy. With the understanding of TGF-β signaling pathway and progressing in the technology of miRNA and RNAi，Gene therapy is more promising in curing ocular fibrotic disorders. Although the gene therapy research in kinds of eye fibrotic diseases is developing rapidly, many problems need to be solved.

gene therapy; ocular fibrotic disorders; transforming growth factor beta; microRNA; RNA interference

2013- 12- 26

2014- 03- 24

*通信作者(correspondingauthor)： zhaoyixi@163.com

1001-6325(2014)09-1289-04

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