草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨酸溶性胶原蛋白特性对比研究

瞿朝霞，刘 焱，2 *，罗 灿，刘伦伦

（1.湖南农业大学 食品科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.湖南农业大学 食品科学与生物技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410128）

胶原蛋白是一种具有重要生理功能的不溶性纤维状蛋白质，由糖、甘氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等组成，3条α链组成三螺旋结构[1-2]。长期以来，胶原蛋白主要从猪牛等的皮肤中提取[3-5]。鱼鳞、鱼皮和鱼骨是鱼类加工中的副产物，其中含有丰富的胶原蛋白，近年来研究发现鱼类资源没有疯牛病等风险，其生物安全性较高，关于鱼副产物胶原蛋白的提取研究越来越多[6]。从不同原料中提取得到的胶原蛋白在结构和性质上存在差异[7]，胶原蛋白的种类和结构特性决定其功能特性，但目前关于鱼类副产物胶原蛋白的研究仅停留在提取工艺的优化层面[8-20]，鲜有关于从不同副产物中提取得到的胶原蛋白特性差异的研究。该文在现有研究基础上，采用已有研究报道的最优工艺条件从草鱼（Ctenopharyngodon idellus）副产物鱼鳞、鱼皮和鱼骨中提取酸溶性胶原蛋白（acid-soluble collagen，ASC），并对其热变性温度及表征特性进行系统的分析比较，以期为今后鱼类副产物胶原蛋白资源的开发及胶原蛋白产品的有效应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜草鱼鱼鳞、鱼皮、鱼骨：湖南农业大学东之源超市；碳酸钠、氢氧化钠、盐酸、异丙醇、甲醇、溴化钾、冰乙酸、氯化钠、冰醋酸、十二烷基硫酸钠等（均为分析纯）、三羟基甲基氨基甲烷（生物试剂）：国药集团化学试剂有限公司；丙烯酰胺（电泳级，纯度＞99%）、过硫酸铵（纯度＞99%）、甘油、溴酚兰、β-巯基乙醇（纯度＞99%）、甘氨酸（纯度＞99%）、考马斯亮蓝R-250、四甲基二乙胺（纯度≥99%）：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

SHZ-D（Ⅲ）减压抽滤装置：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；FD-1D-50真空冷冻干燥机：北京博医康实验仪器有限公司；UV-2450紫外吸收光谱仪：岛津（香港）有限公司；DYCZ-24DN电泳仪：北京市六一仪器厂；Nicolet6700傅里叶红外光谱仪：赛默飞世尔科技有限公司；RVA快速黏度分析仪：北京微讯超剂仪器技术有限公司。

1.3 方法

1.3.1 草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨的预处理

鱼鳞→0.1mol/L NaCO3浸泡6h→0.4mol/L HCl脱钙6h→漂洗→0.1mol/L NaOH脱脂12h→洗净、备用

鱼皮→10%的异丙醇脱脂→0.1 mol/L 氢氧化钠处理脱杂蛋白及色素→洗净、备用

鱼骨→剁碎→0.1mol/L NaOH 4℃浸泡4h→2.5%NaCl处理6h→4℃条件下用0.5mol/L乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）脱杂蛋白、色素及钙质→4℃下10%异丙醇处理24h脱脂→洗净、备用

1.3.2 草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC的提取

预处理后鱼鳞、鱼皮和鱼骨→加0.5mol/L乙酸1∶20（g∶mL）→室温下振荡提取12h→纱布过滤（滤渣续提12h）→合并提取液（4 000r/min离心20min）→上清液→加5mol/L NaCl（使其浓度为0.9mol/L）→静置分层（12h）→离心（5 000r/min）20min→回收上浮絮状物→加0.5mol/L醋酸使其溶解→取清液→加5mol/L NaCl（使其浓度为0.9mol/L）→回收上浮絮状物→透析（透析袋截留分子质量：8 000～14 000u，蒸馏水中透2d，每8h换一次液）→冷冻干燥

1.3.3 草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC的紫外吸收光谱扫描

将5mg冻干的胶原蛋白粉溶于0.5mol/L的乙酸，配成1g/L胶原溶液。用UV-2450紫外分光光度计，在190～400nm波长范围内，高速扫描最大吸收波长，得紫外光最大吸收波图。

1.3.4 草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC的SDS-PAGE电泳

采用十二烷基硫酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）方法分析胶原蛋白样品。取5mg胶原蛋白于0.1mol/L乙酸溶液中在4℃溶胀分散，取0.1mL胶原溶液与0.1mL SDS样品处理液混合后，沸水浴加热2 min点样，开始电泳[21]。其中分离胶为12%的丙烯酰胺；浓缩胶为5%的丙烯酰胺。染色液为0.25%的考马斯亮蓝R-250-甲醇溶液（以体积分数为45%的甲醇作为母液来配制）；脱色液为5%醋酸-7.5%甲醇液（以体积分数为7.5%的甲醇作为母液来配制）。

1.3.5 草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）扫描

取冻干的胶原蛋白2mg与适量KBr压片，置于红外光谱仪的变温附件中。扫描范围为4 000～400cm-1，分辨率为4cm-1。采用仪器的变温附件和控温装置，扫描温度点为20℃、35℃、60℃、90℃、110℃，每个温度点保温20min，对前三个温度点扫描信号累加200次。

1.3.6 草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC热变性温度测定

准确称取75mg的胶原蛋白冻干品溶于25mL 0.1mol/L乙酸中，用超声波促进完全溶解，将快速黏度计设置程序为2℃/min，初始温度为室温23℃，终止温度为60℃，测定黏度，按增比黏度值与温度关系作折线关系图，增比黏度变为原来的50%时所对应的温度即为热变性温度。

2 结果与分析

2.1 草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC的感官性状

将草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨中酸溶性胶原蛋白（ASC）冷冻干燥后观察其组织形态、气味及色泽等感官性状，草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC都有轻微的刺鼻味，但是其冻干品的组织形态存在区别，具体结果见表1。

表1 草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC的感官性状比较Table 1 Sensory properties comparison of acid soluble collagen from grass carp fish scale,skin and bone

由表1可知，3种ASC都存在轻微的刺鼻味，这可能是与原料中存在的腥味物质有关。鱼体含有特殊的腥味，在加工过程中很难去除，在胶原蛋白的提取中未设计去腥工艺，腥味物质残留其中，致使胶原成品存在轻微的刺鼻气味。其在组织形态和色泽上的区别可能与其原料所处的环境有关。

2.2 草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC的紫外吸收光谱分析

图1 鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC紫外吸收图谱Fig.1 UV spectra of acid soluble collagen from grass carp fish scale,skin and bone

图1为草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨酸溶性胶原蛋白的紫外吸收光谱图。由图1可知，在波长220～250nm区内有强吸收峰，说明该溶液中存在有共轭不饱和双键结构的物质。在波长250～290nm内有强吸收峰，说明该溶液中有含苯环结构的物质。而就蛋白质水解溶液而言，脯氨酸、羟脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸5种氨基酸都具有共轭双键的结构，而后三者都是含苯环的芳香族氨基酸，他们的紫外最大吸收峰分别苯丙氨酸257nm、酪氨酸275nm、色氨酸280nm，其中以色氨酸紫外吸收最为强烈，故常利用色氨酸在280nm处有一个紫外强吸收峰对未知蛋白溶液进行定性分析[22]。

从图1可以看出，鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC溶液分别在波长216nm、225nm、230nm处有一个尖锐的吸收峰，这与I型胶原蛋白紫外特征吸收峰出现的位置（225nm左右）基本一致。鱼皮ASC在波长190～210nm处有少量弱吸收峰，鱼鳞ASC在波长250～255nm内有两个弱吸收峰，鱼骨酸溶性胶原蛋白在波长190～220nm位置内有大量弱吸收峰，说明提取物纯度不够，前者可能是由于鱼皮脱脂不够，后者可能是鱼骨脱钙环节中部分钙离子与胶原蛋白交联导致产物不纯。3种酸溶性胶原蛋白在280nm处均没有吸收峰，说明提取液中没有色氨酸，与胶原蛋白氨基酸组成一致。

2.3 草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC的SDS-PAGE电泳分析

图2为草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨中ASC的SDS-PAGE电泳图谱。

图2 鱼鳞、鱼皮和鱼骨酸溶性胶原蛋白SDS-PAGE电泳图谱Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of acid soluble collagen from grass carp fish scale,skin and bone

胶原蛋白呈三螺旋结构，从哺乳动物提取的胶原蛋白三条α肽链可能两条相同，而从鱼类中提取的胶原蛋白3条肽链可能全不同，其中γ三聚体为三条α肽链组成的胶原分子，β二聚体为2条α肽链的组成的胶原分子[23]，电泳图谱中条带的光密度反映提取物的大致浓度，条带出现位置与标准蛋白图谱对比可看出样品蛋白质的肽链组成[24]。由图2可知，草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC的电泳图谱都没有在γ三聚体和β二聚体位置，3种ASC均有α链，草鱼鱼皮ASC的α链位置显示宽且浓，草鱼鱼鳞和鱼骨ASC的α链位置显示相对较窄，相比之下，草鱼鱼骨ASC的α链位置显示更浓一些。3种ASC条带均没有出现其他杂带，说明提取物纯度均较高，但是从图2中未能看出3种ASC在结构上的区别。

2.4 草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC的傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析

分别对草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC进行傅里叶变换红外光谱分析，结果见图3。

图3 草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC傅里叶红外光谱图Fig.3 Fourier infrared spectrogram of acid soluble collagen from grass carp fish scale,skin and bone

酰胺A的吸收峰通常出现在3 440～3 400cm-1，其由游离的N-H伸缩振动产生，但它以氢键形成缔合体后，其峰将向低波数发生位移。由图3可以看出，草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC酰胺A带分别出现在3 313.15cm-1、3 321.14cm-1、3 324.12cm-1处，表明其N-H伸缩均与氢键形成了缔合体。

在波数1 700～16 00cm-1处出现了酰胺Ⅰ带特征吸收峰，是由C=O伸缩振动引起的，1 330～1 220cm-1处出现了酰胺Ⅲ带特征吸收峰，是由C-N伸缩振动和N-H弯曲振动引起的，这两个区域是蛋白质二级结构变化的敏感区域。鱼鳞和鱼骨ASC酰胺Ⅰ带出现在1 654.40cm-1、1 654.40cm-1处，酰胺Ⅱ带出现在1 549.90cm-1、1 547.61cm-1处，酰胺Ⅲ带出现在1 239.32cm-1、1 234.40cm-1处，说明鱼鳞和鱼骨ASC的α-螺旋结构保存完整，存在β-折叠结构，鱼皮ASC在这3个区域都没有吸收峰，说明鱼皮ASC的α-螺旋结构已经被破坏。3种胶原蛋白都是加入乙酸提取得到的，红外光谱结构表明乙酸法提取鱼鳞和鱼骨胶原蛋白时只水解了其非螺旋区域，较大程度的保存了胶原蛋白的三螺旋结构，而乙酸法水解鱼皮制备胶原蛋白时破坏了其三螺旋结构，不能再用于医用生物材料，但可用于鱼皮胶原多肽类产品的生产。

2.5 草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC的热变性温度曲线图分析

热变性温度是胶原蛋白三螺旋被破坏时的温度，它主要由羟脯氨酸含量决定，一般认为水产胶原蛋白热变性温度低于哺乳动物胶原蛋白。有研究指出，胶原蛋白的热稳定性与羟脯氨酸的含量呈正相关关系，含量越高，热稳定性温度就越高，胶原蛋白稳定性也就越强[25]。羟脯氨酸决定热稳定性的本质是羟脯氨酸吡咯环对胶原的二级结构的固定化的贡献和羟脯氨酸的中氢键的作用力。胶原蛋白热稳定性可以由胶原溶液的热变性温度表达，通过热变性曲线来反映。胶原蛋白的变性温度可以通过增比黏度与温度的关系来确定。从胶原蛋白热变性温度曲线上，增比黏度变为原来的50%时所对应的温度即为热变性温度[26]。图4为鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC的增比黏度与温度曲线。

图4 草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC增比黏度与温度曲线图Fig.4 Specific viscosity and temperature curve of acid soluble collagen from grass carp fish scale,skin and bone

从图4可以看出，草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC的热变性温度在31～35℃之间，其中鱼骨ASC（34.5℃）＞鱼皮ASC（32℃）＞鱼鳞ASC（31℃）。这一结果与许多报道相似，这可能与鱼鳞、鱼皮和鱼骨在鱼体中所处部位的不同有关。鱼鳞和鱼皮处于鱼体的外层，且鱼鳞直接接触水环境，所处环境温度比鱼骨所处环境鱼体低，说明胶原蛋白的结构虽然存在遗传稳定性，但其性质与存在的组织和所处的环境密切相关。

3 结论

草鱼鱼鳞、鱼皮和鱼骨ASC的紫外吸收光谱和电泳图谱说明了在分子构型上的差异并不明显，3种ASC紫外特征吸收峰出现位置与I型胶原蛋白紫外特征吸收峰出现的位置基本一致。电泳图谱表明，3种ASC的纯度均较高。但是经过傅里叶红外光谱分析发现，虽然3种ASC在酰胺A带的N-H伸缩均与氢键形成了缔合体，但是酰胺Ⅰ带和酰胺Ⅲ带的特征吸收峰表明草鱼鱼鳞和鱼骨ASC的α-螺旋结构保存较完整，鱼皮ASC的α-螺旋结构已经被破坏；3种ASC中，鱼鳞ASC对热的耐受性低于鱼皮ASC和鱼骨ASC，鱼骨ASC对热的耐受性最高，推测差异产生的原因可能与胶原存在的组织和所处的环境有关。从3种ASC在结构完整性和热稳定性上的差异可知，若要采用酸法制备可用于医用生物材料的高分子胶原蛋白产品，可选择鱼鳞或鱼骨为原料，以鱼皮为原料则适合于制备酸溶性胶原多肽类产品。

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