HPLC-MS/MS法同时测定生药栀子主要成分

嘎拉沁·满都拉, 上井幸司，汤口实，岩佐达郎*

(1. 内蒙古师范大学 化学与环境科学学院，内蒙古 呼和浩特0100022；2. 室兰工业大学，日本 北海道室兰050-8585)



HPLC-MS/MS法同时测定生药栀子主要成分

嘎拉沁·满都拉1,2, 上井幸司2，汤口实2，岩佐达郎2*

(1. 内蒙古师范大学 化学与环境科学学院，内蒙古 呼和浩特0100022；2. 室兰工业大学，日本 北海道室兰050-8585)

目的：建立栀子中主要活性成分京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷同时进行定性定量分析方法。方法：采用HPLC-MS/MS质谱联用技术，同时测定栀子水提取液中主要成分。质谱条件为电喷雾离子源，正离子检测，扫描范围10～1000(m/z)；色谱测定使用ACE C8(100mm×2.1mm,5μm)色谱柱，以甲醇-水梯度洗脱，流速0.2mL· min-1，检测波长240nm，柱温30℃。结果：栀子中确定了京尼平苷、京尼平龙胆二糖苷和羟异栀子苷等3种成分；在定量分析中主要成分京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷均在0.1～100μg·mL-1浓度范围内具有良好的线性关系(r=1.000 00和r =0.999 98)。结论：HPLC-MS/MS法对栀子中主要成分可准确、快速、同时进行定性定量分析，对生药栀子的质量控制提供了参考依据。

栀子；HPLC-MS/MS；京尼平苷；京尼平龙胆二糖苷

栀子(Gardenia jasminoides Ellis)是茜草科(Rubiaceae)植物栀子，其干燥成熟果实，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒等功效[1]。其化学成分主要含环烯醚萜类成分，如京尼平苷(geniposide)、京尼平龙胆二糖苷(genipingentiobioside)、羟异栀子苷(gardenoside)、京尼平苷酸(geniposidic acid)等[2]。现代药理研究表明，栀子具有抗炎、抗氧化、利胆、利尿、抗肿瘤、解热、镇痛、辐射防护、降血脂等多种药理活性，已成为目前研究的热点[3]。

HPLC/MS/MS技术在中药化学成分、质量标准以及指纹图谱研究中具有独特的优势[4,5]。目前，已有的研究是对栀子中栀子酸、京尼平苷(栀子苷)、西红花苷、京尼平等进行HPLC含量测定[6-9]，或者对栀子的化学成分进行定性分析[10-12]，而用色谱法与质谱法同时测定栀子中京尼平苷、京尼平龙胆二糖苷和羟异栀子苷进行定性和定量分析的研究未见相关报道。笔者采用高效液相色谱质谱联用法同时测定栀子中化学活性成分，并对其色谱峰保留时间、一级和二级扫描质谱图与对照品比较，对京尼平苷、京尼平龙胆二糖苷进行了定性定量分析。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

岛津高效液相色谱仪Prominence LC-20A (日本SHIMADZU公司)，液相色谱质谱联用仪API2000 LC/MS/MS三重四极杆质谱系统(美国AB SCIEX公司)，数控式超声波细胞粉碎器，SONOPULS UW2070, BANDELIN，高速大容量冷却离心机7780(日本KUBOTA)，Milli-Q超纯水装置(美国Millipore公司)，紫外可见光分光光度计UVmini-1240(日本岛津)。

1.2 试剂

流动相用甲醇为色谱纯，日本(Wako)；蒸馏水为HPLC用蒸馏水；对照品京尼平苷，日本(Wako)，批号00007070-212；对照品京尼平龙胆二糖苷，四川省维克奇生物科技，批号130527；栀子(购于内蒙古药店)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

对照品京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷分别配置1mg·mL-1的水溶液和1∶1的混合对照品储备溶液，使用前再稀释100倍。

2.2 供试品溶液制备

生药栀子研细，过60目筛，精密称取粉末0.5g，加超纯水10mL，超声 (70W、20kHz) 提取30min，高速离心机离心(3 000rpm)20min，上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，即得。HPLC测定时将供试品溶液再稀释1 000倍后使用。

2.3 色谱、质谱条件

色谱条件：色谱柱：ACE C8(100mm×2.1mm,5μm)色谱柱；流动相：甲醇-水溶液(梯度洗脱)；流速：0.2mL/min；检测波长：240nm；柱温：30℃；进样量：0.5μL。

质谱条件:电离源：电喷雾离子源 (ESI)；扫描模式：正离子检测(positive)；扫描范围：10～1100(m/z)；毛细管电压(IS)：LC-MS为5 500 V; MS/MS为4 500 V; 雾化器压强：LC-MS为50 psi; MS/MS为17 psi；干燥器温度：300 ℃；碎片电压：120 V。实验数据用AB SCIEX公司Analyst 1.4.2软件处理。

2.4 结果

2.4.1 定性分析(质谱测定) 取供试品栀子水溶液，注入质谱联用仪API2000，进行MS测定。测得质谱图中主要峰的质量电荷比分别为410.9 m/z,amu、572.7 m/z,amu和426.9 m/z,amu，见图1。

分别取对照品京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷溶液注入质谱联用仪API2000，进行MS测定。测得对照品京尼平苷(分子量388.1)和京尼平龙胆二糖苷(分子量550.2)的质量电荷比分别为410.8 m/z,amu(M+Na=388.1+22.7 )和572.9 m/z,amu(M+Na=550.2+22.7)，见图2 A、B。对照品的准离子峰进行MS/MS测定，二级质谱碎片离子中分别测得质荷比(22.8±0.5)m/z,amu的离子(图略)，推断为Na离子。

图1 栀子提取液质谱总离子流

图2 对照品质谱

2.4.2 定量分析(液相色谱) 取供试品栀子水溶液，京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷的混合对照品溶液各0.5μL注入高效液相色谱仪中，进行HPLC-MS测定。供试品色谱图中峰1、峰2和峰3的保留时间分别为15.23min、14.16min和11.71min(图3A)，其中峰1和峰2与对照品京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷的保留时间完全吻合(见图3B)。

2.5 线性关系考察

精密吸取对照品京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷的溶液，用超纯水配制分别为0.1、1、5、50、100 mg·mL-1等不同浓度的对照品溶液，每个浓度平行进样测定3次。以对照品浓度C(mg·mL-1)为横坐标，以色谱峰峰面积Y为纵坐标制作标准曲线。求得京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷的直线回归方程及相关系数(r)分别为：

Y=22863X-1045.2 r=1.000 00

Y=18471X-3431.9 r=0.999 98

图3 对照品京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷的混合溶液HPLC图谱

京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷均在0.1～100mg·mL-1浓度范围内呈现良好的线性关系，分析方法学效能指标满足定量分析方法验证要求。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液，室温下放置，照“2.3”项下分别于制备后0、2、4、6、8、10、12h 进样0.5μL。结果京尼平苷的平均峰面积为68 500，RSD为 0.21%，京尼平龙胆二糖苷的平均峰面积为7 417，RSD为 1.22%。表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

2.7 精密度试验

准确吸取供试品溶液，每次进样0.5μL，连续进样5次。测得京尼平苷平均峰面积的RSD为 0.18%，京尼平龙胆二糖苷平均峰面积的RSD为 0.70%。表明本办法精密度良好。

2.8 重复性试验

按“2.3”项下方法平行制备栀子供试品溶液6份，分别进样0.5μL，测定色谱峰面积，用外标法计算含量，求得京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷的平均含量(n=6)分别为4.84%，RSD为0.96%和1.20%，RSD为0.47%，表明该方法重复性良好。

2.9 加标回收率

精密吸取供试品溶液，分别添加1.0ppm浓度的对照品混合溶液，进样0.5μL进行测定。每个添加水平测定5次，京尼平苷的平均加样回收率和RSD分别为 109.13%和0.30%；京尼平龙胆二糖苷的平均加样回收率和RSD分别为94.49%和0.31%。

2.10 含量测定

按“2.3”项下方法制备栀子的供试品溶液6份，分别精密吸取供试品溶液和混合对照品溶液各0.5μL，注入HPLC

仪，测定色谱峰峰面积，外标法计算含量，测得京尼平苷平均含量为4.842%，RSD为0.96%；京尼平龙胆二糖苷平均含量为1.1976%，RSD为0.47%。

3 讨论

本实验对样品进行水、甲醇和甲醇-水混合溶液(50∶50)等不同溶剂进行提取，对比结果表明水提取液测得成分含量较高。分光光度计进行200～650nm波长扫描，对照品京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷的最大吸收峰分别为238nm和239nm，因此后续试验采用240nm检测波长进行两种成分同时检测。液相色谱柱子分别使用C18和C8柱子，均能测得样品的活性成分，但C8柱子更能提高效率，故选择C8柱子。

生药提取液是包含多个化学成分的极其复杂的混合物。色谱法很难同时检测其所有化学成分。质谱检测器可以很好地解决这个问题，它对生药的多种成分均能够检测。本文采用HPLC-MS/MS质谱联用技术所建立的生药栀子中京尼平苷和京尼平龙胆二糖苷含量测定方法高效、准确、全面地评价其活性成分，在生药研究及质量控制方面是一个可行的方法。

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(责任编辑：王尚勇)

2014-01-26

内蒙古自然科学基金项目(2011MS0204)；室兰工业大学重点研究项目(国际合作)

嘎拉沁·满都拉(1968-)，男，蒙古族，工学博士，内蒙古师范大学讲师，研究方向为蒙药、天然药化学成分。

岩佐达郎，日本室兰工业大学教授，博士生导师。

R284.1

A

1673-2197(2014)08-0027-03