刘小红 陈文强 诸葛斌 宗 红
LIU Xiao-hong 1,2 CHEN Wen-qiang 1 ZHU Ge-bin 2 ZONG Hong 2
陆信曜2 方慧英2 宋 健3
LU Xin-yao 2 FANG Hui-ying 2 SONG Jian 3
(1.陕西理工学院生物科学与工程学院,陕西 汉中 723001;2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室,江苏 无锡 214122;3.江南大学化学与材料工程学院,江苏 无锡 214122)
(1.School of Biological Science & Engineering,Shaanxi University of Technology,Hanzhong,Shaanxi 723001,China;2.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology,Ministry of Education and the Research Centre of Industrial Microbiology,Jiangnan University,Wuxi,Jiangsu 214122,China;3.School of Chemical and Material Engineering,Jiangnan University,Wuxi,Jiangsu 214122 China)
甘油是一种应用广泛的食品安全添加剂,在医药、食品、个人护理和化工等1 700个行业[1]有着广泛的应用。在生理活性方面,甘油具有稳定血糖和胰岛素等作用;在果酒行业中,它可以分解果酒中的单宁,提升酒品的品质、口感、去苦味;而在肉干、香肠、腊肉、果脯等产品制作中,可以锁水,保湿,延长保质期。甘油主要被用作甜味剂、乳化剂、保湿剂、烟草吸湿剂、溶剂[2,3],另外还可用于改善食品外观的添加剂[4]。
江南大学[5]采用微生物好氧发酵法生产甘油,已达到年产500 t食品级要求甘油的规模。而对食品级甘油的分子基因水平的研究,目前却比较少。
产甘油假丝酵母是本研究室学者[6]筛选获得的一株可以在高渗条件下,高产食品级甘油的安全工业酵母菌株,甘油的合成是葡萄糖首先经磷酸化和醛缩酶的作用形成3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮,磷酸二羟丙酮在3-磷酸-甘油脱氢酶(CgGPD)的作用下,还原为3-磷酸甘油,此为甘油合成的第一步酶促反应。3-磷酸-甘油在3-磷酸-甘油酯酶(ScGPP2)作用下脱磷酸根而形成甘油,此为甘油合成的最后一个酶促反应。这两步反应中,第一步为甘油合成的关键步骤。而目前对其分子机制的研究较少,本研究通过基因工程改造手段,构建甘油表达体系,进一步提高食品级甘油产量及减少副产物,为降低下游食品级甘油的分离纯化的难度提供有效的依据。
1.1.1 菌株与质粒
产甘油假丝酵母 (Can dida glycerinogenesis WL2002-5)、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae W303-1A)、大肠杆菌 (Escherichia coli JM109)、p MD18-T vector、p E tac vector:江南大学工业微生物与生物反应工程研究中心保藏。
1.1.2 培养基配制
LB液体培养基:酵母膏5 g/L,蛋白胨10 g/L,NaCl 10 g/L,p H 7.0;
YEPD培养基:葡萄糖20 g/L,蛋白胨20 g/L,酵母膏10 g/L,琼脂15~20 g/L,自然p H。
1.1.3 仪器与试剂
PCR仪:ALS1296型,美国BIO-RAD公司;
UVP凝胶成像系统:Alpha Innotech型,英国UVP公司;
p H计:Delta 320型,梅特勒-托利多集团;
回旋式恒温调速摇瓶柜:HYL-B型,上海新星自动化控制设备厂;
离心机:Allegra X-15R型,Beckman公司;
小型离心机:5415R型,Eppendorf公司;
分光光度计:UV1800型,优尼柯仪器有限公司。
高效液相色谱仪:P680型,美国戴安公司。
各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 Ligase:宝生物工程大连有限公司;
B型小量质粒快速提取试剂盒:北京博大泰克生物技术有限责任公司;
San Prep柱式DNA胶回收试剂盒:上海生工生物工程有限公司;
其余试剂:分析纯,国药集团化学试剂有限公司。
1.2.1 PCR扩增 根据GenBank中CgGPD 基因序列(登录号 EU186536.1)和ScGPP 2基因序列 (登录号 NC-001137.3)设计引物(表1)。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。PCR反应条件:CgGPD扩增程序:预变性:94℃4 min;变性:94℃1 min,复性:59℃30 s,延伸:72℃70 s,共30个循环;保温:72℃10 min。ScGPP 2扩增程序:预变性:94℃4 min;变性:94℃1 min,复性:57℃30 s,延伸:72℃70 s,共30个循环;保温:72℃10 min。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。
表1 PCR扩增所用引物Table 1 PCR primers used for amplification
1.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 将重组菌株接种于10 m L LB液体培养基中,OD 值在0.6~0.8时,加入IPTG至终浓度为0.5 m M,30℃诱导表达16 h。收集破碎细胞液,SDS-PAGE检测表达情况。采用5%浓缩胶和12%分离胶的不连续垂直平板电泳进行蛋白分离,考马斯亮蓝 R-250染色[7]。
1.2.3 CgGPD和ScGPP2粗酶液的制备 参照文献[8]。将过夜诱导表达的菌液于4℃以10 000 r/min离心10 min,菌体用细胞洗涤液(KH2PO410 m M,K2HPO410 m M,EDTA 2 m M,p H 7.5)洗涤两遍,然后悬于10 m L破细胞缓冲液中 (KH2PO4100 m M,K2HPO4100 m M,DTT 1 m M,MgCl21 m M,EDTA 2 m M,p H 7.5)。采用超声波法破壁细胞(功率300 W,工作1 s隔3 s,工作3 min),于4℃以10 000 r/min离心10 min,上清即为粗酶液。
1.2.4 酶活测定方法
(1)3-磷酸甘油脱氢酶酶活的测定[8]:GPD活性的检测在检测缓冲液(20 m M 咪唑-HCl,p H 7.0;1 m M DTT;1 m M MgCl2;0.67 m M DHAP;0.09 m M NADH 中进行,酶促反应温度为30℃。无NADH氧化酶本底。在340 nm处测定30 s和90 s的吸光度。一个酶活单位定义为1 min消耗1μM NADH所需的酶量。
(2)3-磷酸甘油酯酶酶活测定:取稀释好的浓度为1 mg/m L的粗酶液50μL,加入0.2 M DL-磷酸甘油10μL,1 M,p H 7.0咪唑10μL,0.25 M MgCl210μL,总体积为0.1 m L。在30℃的恒温水浴中,反应1 min后加入2 m L 5%的三氯乙酸终止反应,离心,取上清液测其无机磷含量。在30℃,p H 7.0的条件下,每分钟催化3-磷酸甘油产生1μM磷酸根所需要的酶量为1个酶单位。
1.2.5 蛋白含量测定 采用Bradford法[9],以BSA为标准蛋白。
1.2.6 产物检测方法 Dionex高效液相色谱仪测定,色谱柱为 Amines HPX-87H(Bio-Rad)有机酸离子交换柱,柱温60℃,流动相为5 m M H2SO4,流速为0.6 m L/min。使用示差折光及紫外检测器,使用外标定量法定量[10]。
以产甘油假丝酵母和酿酒酵母基因组DNA为模板,以P1,P2,P3,P4为引物,扩增获得大小分别约为1 100 bp和750 bp的Cg GPD和ScGPP 2片段,与Genbank公布的基因序列大小(1 167 bp和753 bp)一致[7],结果见图1。
图1 CgGPD和ScGPP 2的PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析Figure 1 Agarose gel electrophoresis of CgGPD and ScGPP 2 genes
质粒构建过程如图2所示,基因片段CgGPD纯化后用EcoRⅠ,Hin dⅢ双酶切,与相同酶切的载体p E tac连接,并转化E.coli感受态细胞;克隆所得基因片段ScGPP 2,用SacⅠ,XhoⅠ 双 酶 切, 与 酶 切 的p E tac 连 接; 以p E tac-ScGPP 2质粒DNA为模板,扩增两端有Hin dⅢ 和XhoⅠ位点的tac-ScGPP 2目的片段,与双酶切的pE tac-CgGPD 连接,完成双启动子pE tac-CgGPD-tac-ScGPP2表达质粒构建。用含有kan抗性的平板筛选转化子,同时,酶切验证,结果见图3、4(a)。
重组菌株 E.coli (pE tac-Cg GPD-tac-ScGPP2)过夜诱导,收集菌体,超声波破碎细胞,进行SDS-PAGE,重组菌释放出的目的条带约42 k Da和27 kDa,与文献[8]报道的大小一致,确定为3-磷酸甘油脱氢酶和为3-磷酸甘油酯酶(见图4(b))。
图2 重组质粒p E tac-CgGPD-tac-ScGPP 2的构建Figure 2 Construction of the plasmid of p E tac-CgGPD -tac-ScGPP 2
图3 p E tac-Cg GPD 和p E tac-ScGPP 2的酶切验证Figure 3 The enzymatic digestion of the plasmid p E tac-Cg GPD and p E tac-ScGPP2
图4 p E tac-CgGPD-tac-ScGPP2的酶切验证及SDS-PAGE检测Figure 4 The enzymatic digestion and SDS-PAGE analysis of the plasmid p E tac-Cg GPD-tac-ScGPP 2
经酶活检测(表2),在E.coli(p E tac-CgGPD)和E.coli(p E tac-CgGPD-tac-ScGPP 2)菌株中CgGPD 酶活分别为0.12 U/mg和0.06 U/mg。在E.coli(p E tac-ScGPP 2)和E.coli(p E tac-CgGPD-tac-ScGPP 2)菌株中ScGPP 2酶活分别是0.03 U/mg和0.01 U/mg。3-磷酸甘油脱氢酶是甘油合成过程中的关键酶基因,其酶活的高低直接影响着甘油的合成,本研究中Cg GPD具有相对较高的酶活,对甘油合成有着重要作用。SDS-PAGE及酶活性分析结果表明,甘油合成基因在大肠杆菌中进行了功能性表达。
E.coli(p E tac-CgGPD-tac-ScGPP2)菌株经发酵培养,在1%,2%,3%,4%葡萄糖浓度下,经48 h后,其胞外甘油分别累积到1.35,1.87,2.52,2.25 g/L,而对照野生菌株中却没有检测到甘油(图5),表明CgGPD在甘油合成过程中起关键作用,过表达CgGPD有助于甘油合成。与刘艳青等[8]构建的串联表达载体合成1.56 g/L甘油相比,本研究所采用的双启动子串联表达,更有利于甘油合成。
表2 酶活及甘油浓度测定Table 2 The specific activity of CgGPD and ScGPP2
图5 不同葡萄糖浓度下甘油含量Figure 5 Concentration of glycerol under difference conditions
本中心已对产甘油假丝酵母甘油合成的高渗调控机制(HOG途径)做了很多的研究[11,12],这些研究对高产食品级甘油具有至关重要的理论指导作用。本课题为了进一步提高食品级产量及减少副产物,减轻下游分离纯化的压力,研究其甘油合成机制中甘油合成关键基因,克隆获得关键酶基因3-磷酸-甘油脱氢酶基因(CgGPD),并在大肠杆菌中通过tac启动子串联表达来自酿酒酵母的3-磷酸 -甘油酯酶基因(ScGPP 2)。在摇瓶发酵过程中可合成2.52 g/L的甘油。相比之前的研究[7],食品级甘油合成量提高了1倍,结果说明通过tac启动子串联表达CgGPD基因,可以获得更高的甘油含量。此研究表明3-磷酸 -甘油脱氢酶(CgGPD)在甘油合成过程中起关键作用,过表达CgGPD有助于甘油合成。
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