安全酵母Can dida glycerin ogen esis食品级甘油合成关键基因的研究

刘小红 陈文强 诸葛斌 宗 红

LIU Xiao－hong 1，2 CHEN Wen－qiang 1 ZHU Ge－bin 2 ZONG Hong 2

陆信曜2 方慧英2 宋 健3

LU Xin－yao 2 FANG Hui－ying 2 SONG Jian 3

（1.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西 汉中 723001；2.江南大学工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122；3.江南大学化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122）

（1.School of Biological Science ＆ Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong，Shaanxi 723001，China；2.The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education and the Research Centre of Industrial Microbiology，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214122，China；3.School of Chemical and Material Engineering，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu 214122 China）

甘油是一种应用广泛的食品安全添加剂，在医药、食品、个人护理和化工等1 700个行业［1］有着广泛的应用。在生理活性方面，甘油具有稳定血糖和胰岛素等作用；在果酒行业中，它可以分解果酒中的单宁，提升酒品的品质、口感、去苦味；而在肉干、香肠、腊肉、果脯等产品制作中，可以锁水，保湿，延长保质期。甘油主要被用作甜味剂、乳化剂、保湿剂、烟草吸湿剂、溶剂［2，3］，另外还可用于改善食品外观的添加剂［4］。

江南大学［5］采用微生物好氧发酵法生产甘油，已达到年产500 t食品级要求甘油的规模。而对食品级甘油的分子基因水平的研究，目前却比较少。

产甘油假丝酵母是本研究室学者［6］筛选获得的一株可以在高渗条件下，高产食品级甘油的安全工业酵母菌株，甘油的合成是葡萄糖首先经磷酸化和醛缩酶的作用形成3－磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮，磷酸二羟丙酮在3－磷酸－甘油脱氢酶（CgGPD）的作用下，还原为3－磷酸甘油，此为甘油合成的第一步酶促反应。3－磷酸－甘油在3－磷酸－甘油酯酶（ScGPP2）作用下脱磷酸根而形成甘油，此为甘油合成的最后一个酶促反应。这两步反应中，第一步为甘油合成的关键步骤。而目前对其分子机制的研究较少，本研究通过基因工程改造手段，构建甘油表达体系，进一步提高食品级甘油产量及减少副产物，为降低下游食品级甘油的分离纯化的难度提供有效的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株与质粒

产甘油假丝酵母 （Can dida glycerinogenesis WL2002－5）、酿酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae W303－1A）、大肠杆菌 （Escherichia coli JM109）、p MD18－T vector、p E tac vector：江南大学工业微生物与生物反应工程研究中心保藏。

1.1.2 培养基配制

LB液体培养基：酵母膏5 g／L，蛋白胨10 g／L，NaCl 10 g／L，p H 7.0；

YEPD培养基：葡萄糖20 g／L，蛋白胨20 g／L，酵母膏10 g／L，琼脂15～20 g／L，自然p H。

1.1.3 仪器与试剂

PCR仪：ALS1296型，美国BIO－RAD公司；

UVP凝胶成像系统：Alpha Innotech型，英国UVP公司；

p H计：Delta 320型，梅特勒－托利多集团；

回旋式恒温调速摇瓶柜：HYL－B型，上海新星自动化控制设备厂；

离心机：Allegra X－15R型，Beckman公司；

小型离心机：5415R型，Eppendorf公司；

分光光度计：UV1800型，优尼柯仪器有限公司。

高效液相色谱仪：P680型，美国戴安公司。

各种限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、T4 Ligase：宝生物工程大连有限公司；

B型小量质粒快速提取试剂盒：北京博大泰克生物技术有限责任公司；

San Prep柱式DNA胶回收试剂盒：上海生工生物工程有限公司；

其余试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR扩增 根据GenBank中CgGPD 基因序列（登录号 EU186536.1）和ScGPP 2基因序列 （登录号 NC－001137.3）设计引物（表1）。引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。PCR反应条件：CgGPD扩增程序：预变性：94℃4 min；变性：94℃1 min，复性：59℃30 s，延伸：72℃70 s，共30个循环；保温：72℃10 min。ScGPP 2扩增程序：预变性：94℃4 min；变性：94℃1 min，复性：57℃30 s，延伸：72℃70 s，共30个循环；保温：72℃10 min。扩增产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

表1 PCR扩增所用引物Table 1 PCR primers used for amplification

1.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE） 将重组菌株接种于10 m L LB液体培养基中，OD 值在0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5 m M，30℃诱导表达16 h。收集破碎细胞液，SDS－PAGE检测表达情况。采用5%浓缩胶和12%分离胶的不连续垂直平板电泳进行蛋白分离，考马斯亮蓝 R－250染色［7］。

1.2.3 CgGPD和ScGPP2粗酶液的制备 参照文献［8］。将过夜诱导表达的菌液于4℃以10 000 r／min离心10 min，菌体用细胞洗涤液（KH2PO410 m M，K2HPO410 m M，EDTA 2 m M，p H 7.5）洗涤两遍，然后悬于10 m L破细胞缓冲液中 （KH2PO4100 m M，K2HPO4100 m M，DTT 1 m M，MgCl21 m M，EDTA 2 m M，p H 7.5）。采用超声波法破壁细胞（功率300 W，工作1 s隔3 s，工作3 min），于4℃以10 000 r／min离心10 min，上清即为粗酶液。

1.2.4 酶活测定方法

（1）3－磷酸甘油脱氢酶酶活的测定［8］：GPD活性的检测在检测缓冲液（20 m M 咪唑－HCl，p H 7.0；1 m M DTT；1 m M MgCl2；0.67 m M DHAP；0.09 m M NADH 中进行，酶促反应温度为30℃。无NADH氧化酶本底。在340 nm处测定30 s和90 s的吸光度。一个酶活单位定义为1 min消耗1μM NADH所需的酶量。

（2）3－磷酸甘油酯酶酶活测定：取稀释好的浓度为1 mg／m L的粗酶液50μL，加入0.2 M DL－磷酸甘油10μL，1 M，p H 7.0咪唑10μL，0.25 M MgCl210μL，总体积为0.1 m L。在30℃的恒温水浴中，反应1 min后加入2 m L 5%的三氯乙酸终止反应，离心，取上清液测其无机磷含量。在30℃，p H 7.0的条件下，每分钟催化3－磷酸甘油产生1μM磷酸根所需要的酶量为1个酶单位。

1.2.5 蛋白含量测定 采用Bradford法［9］，以BSA为标准蛋白。

1.2.6 产物检测方法 Dionex高效液相色谱仪测定，色谱柱为 Amines HPX－87H（Bio－Rad）有机酸离子交换柱，柱温60℃，流动相为5 m M H2SO4，流速为0.6 m L／min。使用示差折光及紫外检测器，使用外标定量法定量［10］。

2 结果与分析

2.1 关键酶基因CgGPD及ScGPP 2的克隆

以产甘油假丝酵母和酿酒酵母基因组DNA为模板，以P1，P2，P3，P4为引物，扩增获得大小分别约为1 100 bp和750 bp的Cg GPD和ScGPP 2片段，与Genbank公布的基因序列大小（1 167 bp和753 bp）一致［7］，结果见图1。

图1 CgGPD和ScGPP 2的PCR产物琼脂糖凝胶电泳分析Figure 1 Agarose gel electrophoresis of CgGPD and ScGPP 2 genes

2.2 关键基因表达质粒的构建

质粒构建过程如图2所示，基因片段CgGPD纯化后用EcoRⅠ，Hin dⅢ双酶切，与相同酶切的载体p E tac连接，并转化E.coli感受态细胞；克隆所得基因片段ScGPP 2，用SacⅠ，XhoⅠ 双 酶 切， 与 酶 切 的p E tac 连 接； 以p E tac－ScGPP 2质粒DNA为模板，扩增两端有Hin dⅢ 和XhoⅠ位点的tac－ScGPP 2目的片段，与双酶切的pE tac－CgGPD 连接，完成双启动子pE tac－CgGPD－tac－ScGPP2表达质粒构建。用含有kan抗性的平板筛选转化子，同时，酶切验证，结果见图3、4（a）。

2.3 关键基因表达及活性分析

重组菌株 E.coli （pE tac－Cg GPD－tac－ScGPP2）过夜诱导，收集菌体，超声波破碎细胞，进行SDS－PAGE，重组菌释放出的目的条带约42 k Da和27 kDa，与文献［8］报道的大小一致，确定为3－磷酸甘油脱氢酶和为3－磷酸甘油酯酶（见图4（b））。

图2 重组质粒p E tac－CgGPD－tac－ScGPP 2的构建Figure 2 Construction of the plasmid of p E tac－CgGPD －tac－ScGPP 2

图3 p E tac－Cg GPD 和p E tac－ScGPP 2的酶切验证Figure 3 The enzymatic digestion of the plasmid p E tac－Cg GPD and p E tac－ScGPP2

图4 p E tac－CgGPD－tac－ScGPP2的酶切验证及SDS－PAGE检测Figure 4 The enzymatic digestion and SDS－PAGE analysis of the plasmid p E tac－Cg GPD－tac－ScGPP 2

经酶活检测（表2），在E.coli（p E tac－CgGPD）和E.coli（p E tac－CgGPD－tac－ScGPP 2）菌株中CgGPD 酶活分别为0.12 U／mg和0.06 U／mg。在E.coli（p E tac－ScGPP 2）和E.coli（p E tac－CgGPD－tac－ScGPP 2）菌株中ScGPP 2酶活分别是0.03 U／mg和0.01 U／mg。3－磷酸甘油脱氢酶是甘油合成过程中的关键酶基因，其酶活的高低直接影响着甘油的合成，本研究中Cg GPD具有相对较高的酶活，对甘油合成有着重要作用。SDS－PAGE及酶活性分析结果表明，甘油合成基因在大肠杆菌中进行了功能性表达。

2.4 关键基因表达菌株的发酵

E.coli（p E tac－CgGPD－tac－ScGPP2）菌株经发酵培养，在1%，2%，3%，4%葡萄糖浓度下，经48 h后，其胞外甘油分别累积到1.35，1.87，2.52，2.25 g／L，而对照野生菌株中却没有检测到甘油（图5），表明CgGPD在甘油合成过程中起关键作用，过表达CgGPD有助于甘油合成。与刘艳青等［8］构建的串联表达载体合成1.56 g／L甘油相比，本研究所采用的双启动子串联表达，更有利于甘油合成。

表2 酶活及甘油浓度测定Table 2 The specific activity of CgGPD and ScGPP2

图5 不同葡萄糖浓度下甘油含量Figure 5 Concentration of glycerol under difference conditions

3 结论

本中心已对产甘油假丝酵母甘油合成的高渗调控机制（HOG途径）做了很多的研究［11，12］，这些研究对高产食品级甘油具有至关重要的理论指导作用。本课题为了进一步提高食品级产量及减少副产物，减轻下游分离纯化的压力，研究其甘油合成机制中甘油合成关键基因，克隆获得关键酶基因3－磷酸－甘油脱氢酶基因（CgGPD），并在大肠杆菌中通过tac启动子串联表达来自酿酒酵母的3－磷酸 －甘油酯酶基因（ScGPP 2）。在摇瓶发酵过程中可合成2.52 g／L的甘油。相比之前的研究［7］，食品级甘油合成量提高了1倍，结果说明通过tac启动子串联表达CgGPD基因，可以获得更高的甘油含量。此研究表明3－磷酸 －甘油脱氢酶（CgGPD）在甘油合成过程中起关键作用，过表达CgGPD有助于甘油合成。

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7 聂玲燕，方慧英，诸葛斌，等.克雷伯氏菌产1，3－丙二醇菌株选育及甘油脱水酶基因转录分析［J］.应用于环境生物学报，2013，19（1）：25～29.

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12 Xiaona Gao，Bin Zhuge，Huiying Fang，et al.The construction of a new integrative vector with a new selective marker of copper resistance for glycerol producer Can dida glycerinogenes ［J］.Curr Microbiol，2012（64）：357～364.