赖红芳 黄秀香 陆俊宇
LAI Hong-fang HUANG Xiu-xiangLU Jun-yu
(河池学院化学与生命科学系,广西 河池 546300)
(Department of Chemistry and Life Science,Hechi University,Hechi,Guangxi 546300,China)
山豆根为豆科槐属植物越南槐 (Sophora tonkinensis Gapnep.)的干燥根及根茎[1],别名广豆根、苦豆根、山大豆根(主要分布在广西地区石灰岩山地)。其味极苦、性寒、有毒,具有清热解毒、消肿利咽的功效,主治火毒蕴结、咽喉肿痛、齿龈肿痛等症[2]。山豆根的化学成分主要有生物碱、多糖、酚类、黄酮类等化合物[3]。其中黄酮类具有抗自由基能力[4]、抗炎作用[5]、抗肿瘤活性[6,7]等。而山豆根多糖具有体外清除活性氧自由基作用,也可能具有保护肝脏作用[8]。
目前,鲜见对山豆根黄酮和多糖的研究,其中关于黄酮的报道[9]只是研究了提取方法,而未进行工艺条件的优化;且多糖的提取[10]采用的是传统方法,提取率不高。超声波法是利用低频超声条件下对中药有效成分进行提取,并不改变药物成分,并具有省时,操作简单、快速等特点[11]。因此本研究拟采用超声波进行辅助提取,结合正交试验,分别对山豆根中的黄酮和多糖的提取工艺参数进行优化,为山豆根开发的工业化提供理论依据。
1.1.1 材料与试剂
山豆根:购于宜州中药市场;
芦丁:UV≥98%,批号:20110825,上海源叶生物科技有限公司;
浓硫酸、苯酚、柠檬酸、磷酸氢二钠、无水乙醇、葡萄糖、氢氧化钠溶液、硝酸铝、亚硝酸钠等:均为市售分析纯。
1.1.2 主要仪器设备
紫外分光光度计:UV-2102PCS型,尤尼科仪器有限公司;
电子分析天平:AE240S型,梅特勒-托利多仪器有限公司;
p H计:PHS-3B型,上海精密科学仪器有限公司;
循环水式多用真空泵:SHB-Ⅲ型,郑州长城科工贸易有限公司;
电热恒温水浴锅:SSY4型,北京泰克仪器有限公司;
超声波仪:JY92-Ⅱ型,宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.2.1 山豆根的预处理 将烘干的山豆根粉碎后过20目筛,备用。取一部分用60%乙醇浸泡24 h进行脱脂。抽滤,在60℃恒温烘干24 h后,备用。
1.2.2 山豆根中黄酮成分的提取
(1)提取方法:准确称取山豆根粉末2 g,在一定料液比下加入一定浓度的乙醇提取剂,调节溶液p H,超声波处理一定时间,抽滤,置于100 m L容量瓶中,用30%乙醇稀释至刻度,得粗黄酮样品液,备用。
(2)芦丁标准曲线的制作:根据文献[12],得芦丁质量浓度(mg/m L)与吸光度A 的关系方程为y=14.346x+0.002 2,r =0.999 7。
(3)山豆根黄酮含量的测定:准确吸取样品液2 m L,置于25 m L刻度试管中,按标准曲线制作的方法进行操作,在波长为510 nm下测定吸光度。并按回归方程计算样品溶液中黄酮的浓度。按式(1)求出样品中黄酮的含量。
式中:
R——黄酮含量,%;
C——由标准曲线求得的黄酮的浓度,mg/m L;
V1—— 稀释体积,m L;
V2—— 样品溶液的体积,m L;
M—— 样品质量,g;
V3—— 吸取样品溶液的体积,m L。
1.2.3 山豆根中多糖的提取
(1)提取方法:准确称取2 g脱脂后的山豆根粉末,在一定料液比、溶液p H、提取时间、提取次数的条件下提取,抽滤,合并滤液,转入250 m L容量瓶,定容。取2 m L上述溶液于50 m L容量瓶,定容,待测。
(2)葡萄糖标准曲线的制作:根据文献[13],得回归方程:y =0.005 6x+0.010 2,r=0.999 2。
(3)换算因子的测定:根据文献[14],制备山豆根粗多糖后,经过测定及计算得到换算因子为f=5.3。
(4)多糖含量的测定:吸取2.0 m L样品液于25 m L比色管,按标准曲线方法进行显色测定吸光度,并按回归方程计算样品溶液中葡萄糖的浓度,按式(2)计算样品多糖含量。
式中:
Y——多糖提取率,%;
W——山豆根样品的质量,g;
C—— 多糖中葡萄糖的质量浓度,μg/m L;
D——山豆根多糖的稀释倍数;
f——换算因子。
2.1.1 正交试验结果与分析 通过前期单因素试验结果,对影响山豆根黄酮提取率的不同因素进行了初步的筛选,确定以溶液p H、乙醇用量、提取时间、乙醇的浓度为考察因素,并进行正交试验。以山豆根中黄酮含量为考察指标,采用四因素三水平L9(34)进行正交试验,试验因素水平见表1,结果见表2。
表1 L9(34)因素水平表Table 1 L9(34)factors level table
表2 正交试验结果与分析Table 2 Orthogonal test results
由表2可知,4个因素对山豆根黄酮提取率的影响顺序为A>B>D>C,即料液比>乙醇浓度>提取时间>p H值;根据极值大小确定山豆根黄酮的最佳提取工艺为A3B3C2D2,即料液比在1∶45(m∶V),乙醇浓度为100%,p H值为5,提取时间为70 min。
2.1.2 验证实验 准确称取5份山豆根粉末2 g,按最佳条件提取,得待测液,按1.2.2标准曲线操作测定,计算出黄酮含量及 RSD。黄酮含量分别为8.59,8.61,8.61,8.61,8.60 mg/g,平均含量为8.60 mg/g,RSD为0.1% (n =5),说明工艺精密度高。
2.1.3 加样回收试验 准确吸取最佳条件下提取的样品溶液2 m L于25 m L的比色皿中,平行5份,分别加入0.1 mg的芦丁标准溶液,按标准曲线显色,分别测其吸光度A值。根据回收率公式算出加样回收率,结果见表3。由表3可知,平均回收率为95.52%,说明符合加标回收的要求。因此,分析结果是准确的。
表3 黄酮加样回收率试验Table 3 Flavonoids plus sample recovery experiment
2.2.1 正交试验 通过前期单因素试验结果,确定料液比、超声时间、提取p H、提取次数为主要影响因素,设计四因素三水平试验。试验方案设计及结果见表4和表5。
表4 正交试验因素水平表Table 4 Factor sand levels of orthogonal test
表5 正交试验结果与分析Table 5 Results of orthogonal experiment
由表5可知,提取次数对山豆根多糖的提取结果影响最大,提取时间次之,提取p H影响最小;其最佳的提取条件为A2B1C3D3,即料液比为1∶20(m∶V),提取时间为30 min,提取p H=4.50,提取次数3次。
2.2.2 验证实验 在最佳工艺条件下,进行5次重复性试验,按1.2.3标准曲线测定并算出多糖含量及RSD。多糖提取率分别为6.06%,6.13%,6.06%,6.08%,6.07%,平均提取率为6.08%,RSD为2.83%(n=5),说明该工艺稳定。
2.2.3 加样回收率试验 准确吸取已知含糖量的样品液5份,加入200μg葡萄糖,按标准曲线制作方法显色,测定吸光度,根据公式算出样品中多糖含量和加样回收率。由表6可知,回收率为91.2%,说明山豆根多糖测定方法可行。
表6 回收试验结果Table 6 Recovery experiment
(1)超声波法提取山豆根黄酮最佳工艺。考察结果为将2 g山豆根粉末,在p H=5时用90 m L无水乙醇超声提取70 min。在此条件下山豆根黄酮的得率为8.60 mg/g。
(2)超声波提取山豆根多糖的最佳工艺条件为料液比1∶30(m∶V),提取时间20 min,提取p H 4.50,提取次数3次。在此条件下山豆根多糖的提取率最高,为6.08%。
(3)利用超声波辅助法提取山豆根中黄酮并对其工艺进行优化,为其工业化生产提供思路,而且最佳工艺条件下的提取率远高于文献[9]中的提取率。而在对多糖提取中,试验结果比文献[10]的水提醇沉法提取率几乎提高1倍,大大提升了原料的利用率。同时超声波具有操作简单、快速、高效、污染低等特点,在工业化生产值得推广。
1 国家药典委员会.中国药典 (一部)[M].北京:化学工业出版社,2005.
2 丁佩兰,郁韵秋,王钢力,等.RP-HPLC法评价山豆根药材质量[J].复旦学报(医学版),2004,31(2):208~210.
3 邓银华,徐康平,章为,等.山豆根化学成分研究[J].天然产物研究与开发,2005,17(2):172~174.
4 杜士明,周本宏,杨光义.山豆根水提物抗炎作用研究[J].中国药房,2008,19(18):1 371~1 372.
5 窦金辉,李家实,阎文玫.山豆根生物碱成分的研究[J].中国中药杂志,1989,14(5):40~42.
6 宋明山,邢念增.槲皮素诱导TRAMP-C2细胞凋亡的实验研究[J].临床泌尿外科杂志,2008,23(9):708~711.
7 徐永中,范钰,姚广涛.槲皮素抑制胃癌BGC823细胞增殖的研究[J].时珍国医国药,2008,19(8):1 990~1 991.
8 胡庭俊,程富胜,陈炅然,等.山豆根多糖体外清除自由基作用的研究[J].中兽医医药杂志,2004,23(5):6~7.
9 廖莉,邹勇芳,林培青,等.超声波提取山豆根总黄酮及鉴定[J].农业机械,2011,26(9):156.
10 尹龙萍,邓毅,贾伟,等.山豆根粗多糖最优化提取工艺研究[J].中药材,2007,30(3):351~353.
11 赖红芳;黄秀香;韦瑞松.超声波法优化一点红多糖提取工艺[J].食品科技,2012,37(1):182~185.
12 李胜华,伍贤进,郁建平.超声波提取鱼腥草叶总黄酮优化工艺研究[J].食品科学,2006,27(12):207~273.
13 黄琼,丁玲.微波协同酶法提取金针菇多糖工艺的优化[J].食品与机械,2013,29(1):128~130.
14 黄秀香,覃玥,黄艳梅.半枝莲多糖提取工艺优化[J].食品与机械,2013,29(2):128~129.