免疫PCR方法快速检测饮料中的赤藓红

龚 强 丁 利 肖家勇 罗斯斯 焦艳娜

GONG Qiang 1 DING Li 1 XIAO Jia－yong 1 LUO Si－si 2 JIAO Yan－na 1

朱绍华1 文江为1 付善良1 王利兵1

ZHU Shao－hua 1 WEN Jiang－wei 1 FU Shan－liang 1 WANG Li－bing 1

（1.湖南出入境检验检疫局技术中心食品安全科学技术湖南省重点实验室，湖南 长沙 410004；2.上海出入境检验检疫局，上海 200135）

（1.Technology Center of Hunan Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Hunan Key Laboratory of Food Safety Science and Technology，Changsha，Hunan 410004，China；2.Shanghai Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135，China）

合成色素即人工合成色素，用于食品中增加色泽的非营养成分，主要以化工产品为原料经有机反应合成。这类色素大多具有一定毒性，包括毒性、致泄性、致癌性，其中偶氮化合物合成着色剂的致癌作用最为明显［1，2］，中国《食品添加剂使用卫生标准》明确规定了合成色素的使用品种和使用量，其他国家也均严格控制其应用范围和使用量［3，4］。饮料中添加合成色素的现象较为常见，超范围、超剂量使用情况也时有报道，对人们的健康安全存在很大隐患。因此检测饮料中合成色素的含量具有重要意义。

目前，国家标准、文献［5，6］报道中合成色素的检测主要为高效液相色谱法，偶有液相色谱串联质谱检测方法报道［2］，方法前处理较为繁琐。1992年Sano等［7］将免疫反应中抗原抗体反应的高度特异性与PCR技术中的高灵敏度、高扩增效能结合起来，开发了免疫－PCR技术（immuno polymerase chain reaction，IPCR）。已有报道［8－12］表明该方法在致病微生物检测、肿瘤标记物追踪、细胞因子分析以及毒素定量等生物技术领域获得了较好的研究效果，但该方法应用于食品科学中小分子物质的检测还鲜有报道［13］。赤藓红是合成色素中的一种，常用于饮料。本试验以赤藓红作为研究对象，采用免疫PCR方法，建立饮料中赤藓红的间接竞争免疫PCR检测方法，检测低限为10.0 fg／g，适用于不同饮料中赤藓红及其他合成色素的痕量、快速检测。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

1.1.1 试剂

4 －（N－马来酰亚胺甲基）环己烷－1－羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐（Sulfo－SMCC）、戊二醛、牛血清白蛋白（BSA）、吐温－20：美国Sigma－Aldrich公司；

NaCl、EDTA：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

赤藓红标准品：中国计量科学研究院；

赤藓红多克隆抗体：江南大学食品安全科学研究所；

超滤管：截留分子量10，30 K，美国Millipore公司；

SYBR?Premix EX Taq TM Ⅱ荧光PCR试剂盒：日本Takara公司；

其他试剂：除另有规定外，均为分析纯试剂；

试验用水：超纯水。

1.1.2 DNA分子（Takara合成）

上游引物：5’－GGGAAAATGCAAGAAGAAGTCAT－3’；

下游引物：5’－GCCGAAAAATCTGGAAGGTC－3’；

5 ’端 巯 基 修 饰 探 针 （89 bp ssDNA）：5’－SH－GGGAAAATGC AAGAAGAAGT CATTAGTCCT AGACAACGTT ACTATAACGT GAATGTAATG AACCTACAAG ACCTTCCAGA TTTTTCGGC－3’。

1.2 仪器

荧光定量PCR仪：PRISM 7000型，美国生物公司；

振荡器：SA300 Shaker型，日本Yamato公司；

微孔板振荡器：THERMO Star型，美国 Bmg Labtech公司；

离心机：Beckman Coulter型，德国贝克曼公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA－赤藓红抗体偶联物的制备 2.5 mg双异功能团偶联剂Sulfo－SMCC溶解于1 m L超纯水，取10μL溶于980μL PBS缓冲液（含 150 m M NaCl）中，加入 20μL 80μg／m L赤藓红抗体溶液，室温振荡反应30 min，用截留分子量为10 K的超滤管对反应混合物物进行超滤（水平转子，5 000 r／min离心50 min），除去多余的偶联剂。截留物用990μL PBS缓冲液（含5 m M EDTA）复溶，加入10μL 1.0μM ssDNA，室温振荡反应30 min，反应混合物用截留分子量30 K的超滤管进行超滤，除去未结合的DNA。截留物再用1 m L PBS（含5 m M EDTA）溶解，溶解产物即为DNA－赤藓红抗体偶联物。

1.3.2 抗原包被PCR管 荧光定量PCR管用50μL 0.8%的戊二醛溶液37℃包被5 h，超纯水振荡洗涤PCR管3次，每次5 min；50μL 0.3μg／m L的赤藓红抗原包被PCR管，37℃包被2 h，100μL p H 7.2 PBST（含0.05%Tween－20 PBS）缓冲液振荡洗涤3次，每次3 min，再用100μL p H 7.2封闭液（含1%BSA的PBS缓冲液）37℃封闭2 h，上述PBST缓冲液振荡洗涤3次，每次3 min。

1.3.3 免疫传感器的构建 取上述包被好PCR管，加入25μL 10倍梯度稀释浓度系列的赤藓红标准品（浓度从0.05～50.0 pg／m L），每管中分别再加入25μL DNA－赤藓红抗体偶联物，标准品中的赤藓红与PCR管壁上包被的抗原竞争结合抗体，37℃反应30 min，用PBST缓冲液振荡洗涤3次，每次3 min，最后将PCR管在吸水纸上拍打干净。加入SYBR?Premix EX Taq TM Ⅱ2×Buffer 10μL，上游引物、下游引物各0.8μL，ROX Reference Dye 0.4μL，灭菌蒸馏水补足到20μL。荧光定量PCR仪测定。扩增条件：95℃预变性30 s，95℃变性5 s，60℃退火和延伸30 s，40个循环。获得偶联DNA的扩增曲线、熔解曲线。

1.3.4 样品检测 选取市售饮料作为检测研究对象，样品用超纯水稀释1 000倍，过0.22μm滤膜后直接进行竞争性免疫PCR检测，根据标准品Ct曲线计算浓度值。

2 结果与分析

2.1 荧光PCR检测

荧光定量PCR采用SYBR?GreenⅠ嵌合荧光染料，从溶解曲线上可见78℃处有单一峰，无非特异性扩增及引物二聚体（见图1）。试验中的SYBR?Premix EX Taq TM Ⅱ荧光PCR试剂采用SYBR?GreenⅠ嵌合荧光染料，能够在较宽的范围内进行准确地定量，具有抑制非特异性反应、再现性好的特性。

图1 荧光PCR溶解曲线Figure 1 Dissociation curve of fluorescence PCR

2.2 验包被原、DNA－抗体偶联物浓度的优化

包被原和DNA－抗体偶联物的浓度比例按照ELISA棋盘法进行优化，包被原的浓度参照普通ELISA的包被浓度，从1.0μg／m L 10倍梯度稀释至0.01 ng／m L，抗体－DNA偶联物（抗体 40.0 ng／m L、DNA 40 n M）2倍梯度稀释至1.0 ng／m L（以抗体浓度计），加入同样浓度的赤藓红进行荧光PCR反应，根据同一条件下加入目标物和未加目标物循环数的差值，选取最合适的浓度配比。扩增效率越高，循环数差值越大，最终确定包被原浓度0.2μg／m L，抗体浓度10.0 ng／m L，DNA浓度10 n M。

2.3 方法线性范围与检测低限

固定包被原浓度0.2μg／m L、抗体浓度10.0 ng／m L、DNA浓度10 n M，优化竞争性赤藓红浓度：从5.0μg／m L 10倍梯度稀释至5.0 fg／m L，试验结果表明：Ct值随着加入标准品赤藓红浓度的增加而增大（见图2），当赤藓红浓度大于0.5 ng／m L时，Ct值与空白对照（不加赤藓红标准品）无明显差异。以浓度为横坐标，Ct值为纵坐标绘制标准曲线，在0.05～50.0 pg／m L浓度范围内呈良好的线性关系（见图3），线性方程为y＝0.336x＋11.69，相关系数为0.995 0，检测底限为10.0 fg／m L。线性范围为0.05～50.0 pg／m L，赤藓红浓度为0.05，0.5，5.0，50.0 pg／m L时对应的Ct值分别为12.03，12.39，12.66，13.06，相关系数为0.995 0。

图2 竞争性赤藓红线性范围免疫PCR扩增图Figure 2 Linear Immuno－PCR amplification of competitive erythrosine

图3 赤藓红免疫PCR检测标准曲线图Figure 3 Standard curve of erythrosine by Immuno－PCR

2.4 方法的回收率与精密度

采用市售空白饮料样品进行加标回收试验，选择高、中、低（50.0，2.0，0.05 pg／m L）3个浓度，按照上述方法分别进行添加回收试验，每个添加浓度平行测定6次，取平均值计算加标回收率和精密度。由表1可知，方法平均回收率为60%～120%，精密度＜20%，回收率高，重复性好。

表1 阴性样品添加回收率和精密度Table 1 Recoveries and precisions of negative samples（n ＝6）

2.5 实际样品的检测

对市售10种饮料分别采用国家标准（液相色谱法）和本方法进行检测，其中1份阳性样品重复检测6次（见表2），采用方差分析，P＜0.05，表明两种方法检测结果相比较无显著差异。

表2 阳性样品检测结果Table 2 Results of positive sample／（mg·L－1）

3 结论

本试验通过对免疫PCR方法条件的优化、空白样品的添加回收试验以及实际样品的检测，建立了饮料中赤藓红的免疫PCR快速检测方法，方法快速、简便，与常规液相色谱法比较检测结果无显著差异。所建立的方法适合用于饮料中赤藓红的快速检测。

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