前处理及定量方法对奶粉中氯霉素含量测定结果的影响

周兴旺 张继红 邹 桥 张 丽

ZHOU Xing－wang ZH ANG Ji－hong ZOU QiaoZH ANG Li

（湖南省食品质量监督检验研究院，湖南 长沙 410117）

（Hunan Institute of Food Quality Supervision Inspection and Research，Changsha，Hunan 410117，China）

氯霉素具有广谱抗菌能力，曾被广泛应用于动物养殖业，但氯霉素用于食用性动物会通过食物链传递给人类，人体长期食用含氯霉素的食物，会造成肠道正常菌群失调，并抑制骨髓造血功能［1－3］。中国农业部第235号公告《动物源性食品中兽药最高残留限量》中明确规定氯霉素禁止使用，在动物性食品中不得检出。欧盟、美国的法规均明确规定在食品中“不得检出”氯霉素。因此，准确测定奶粉中的氯霉素十分重要。目前，中国关于奶粉中氯霉素含量测定的文献报道较少，任佳等［4，5］介绍的检测奶粉中氯霉素的检测方法，其前处理步骤长，且较复杂。中国也没有相应的国家标准，中国各实验室检测奶粉中氯霉素的方法也没有统一，关于不同样品前处理方法及定量方法对测定结果的影响也未见报道。因此，比较分析不同前处理方法和定量方法对测定结果的影响对于准确测定奶粉中的氯霉素含量具有十分重要的意义。本研究拟参考中国常用的国家标准［6，7］，探讨不同样品前处理方法及定量方法对检测结果精度的影响，旨在为广大分析工作者和标准制修订工作者提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

奶粉：为抽查购买的样品（用方法A确定是阴性或阳性样品），留作科研样品用；

氯霉素标准品：纯度98.5%，德国 Dr.Ehrenstorfer公司；

D5－氯霉 素 内 标 物：100ug／m L，德 国 Dr.Ehrenstorfer公司；

乙腈：色谱纯，美国Tedia公司；

乙酸乙酯、正己烷、乙酸铵：国产分析纯试剂；

液相色谱－三重四极杆串联质谱仪：Thermo TSQ Ultra AM型，美国 Thermo Fisher公司；

色谱柱：Hypersil Gold型，美国 Thermo Fisher公司；

高速振荡器：CUTE MIXER CM－1000型，日本 Tokyo Rikakakai公司；

离心机：TG16－WS型，湖南湘仪仪器开发公司；

漩涡混匀器：VORTEX－2型，美国 Scientific Industries公司；

氮吹仪：TTL－DCⅡ型，北京同泰联科技发展有限公司；

电子天平：Sartouris BS224S型，北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 不同前处理方法

（1）前处理方法 A：参考 GB／T 22338－2008 中的5.3.1.1，称 取 2 g 试 样 至 50 m L 塑 料 离 心 管 中，加 入0.2 m L D5－氯霉素内标溶液（10 ng／m L）、10 m L 饱和氯化钠、10 m L乙腈，漩涡混匀后高速震荡提取5 min，以6 000 r／min离心10 min，上清液收集于玻璃管中，残渣再加入5 m L乙腈重复提取1次，合并上清液于玻璃管中，60℃氮吹至约2 m L，加入乙腈饱和的正己烷除去脂肪，乙腈溶液继续吹干，残留物用1.0 m L乙腈水混合溶剂（20∶80）溶解，用0.22μm有机滤膜过滤后上机测定，内标法定量。

（2）前处理方法 B：参考 GB／T 22338－2008 中的5.3.1.1，与处理方法 A 基本一致，只是没有加入饱和氯化钠。

（3）前处理方法 C：参考 GB／T 22338－2008 中的5.3.1.3，称取2.00 g试样至50 m L塑料离心管中，加入2 m L水溶解样品，并加入0.2 m L D5－氯霉素内标溶液（10 ng／m L）、10 m L 乙 酸 乙 酯，高 速 漩 涡 萃取 5 min，以6 000 r／min离心10 min，上清液收集于玻璃管中，残渣再加入5 m L乙酸乙酯提取1次，合并提取液，乙酸乙酯提取液在60℃减压旋转浓缩至干，残留物用2.0 m L乙腈溶解，加入乙腈饱和的正己烷除去脂肪，乙腈溶液继续吹干，残留物用1.0 m L乙腈水混合溶剂（20∶80）溶解，用0.22μm有机滤膜过滤后上机测定，内标法定量。

（4）前 处 理 方 法 D：参 考 SN／T 1864－2007 中 的2.4.2.a，基本与C处理方法一致，只是没有加入2 m L水。1.2.2 定容溶剂的选择 分别用纯水、纯乙腈和乙腈＋水混合溶剂（体积比＝20／80）配制氯霉素的标准使用液，并上机分析。

1.2.3 加标回收率试验 称取2.00 g阴性奶粉样品，加入2 ng／m L的氯霉素标准溶液1 m L，然后按照 A、B、C、D 4种方法进行前处理，并用内标法定量。

1.2.4 不同定量方法的比较研究 将方法A处理的阳性样品溶液，上机测定，分别用外标法和内标法进行定量分析。

1.3 测定条件

1.3.1 色谱参考条件 色谱柱：Hypersil Gold，150 mm×4.6 mm，3μm；流动相：5 m M 乙酸铵水溶液、水和乙腈，梯度条件见表1；流速：0.200 m L／min；进样量：5μL。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Binary mobile phase composition program

1.3.2 质谱分析条件 采用电喷雾离子化源（ESI），通过负离子多反应检测模式（MRM）对氯霉素及其内标物进行监测。喷雾电压：2 500 V；蒸发温度：300 ℃；鞘气压力：300 k Pa；扫气压力：0 Pa；辅助气流量：5 L／min；毛细管温度：350℃。定性离子对、定量离子对、碰撞气能量及去簇电压见表2。

表2 氯霉素及内标物的质谱参数Table 2 Mass spectral parameters of chloramphenicol and internal standard

2 结果与讨论

2.1 定容溶剂的选择

氯霉素在乙腈的溶解性优于在纯水中的，但流动相的初始条件中乙腈的含量约为20%，用纯乙腈溶解的标准溶液，其总离子流色谱图峰形不好，而用乙腈＋水的混合溶剂（20∶80）配制的标准溶液，其峰形较好（见图1），这是由于色谱分析中的溶剂效应。另外，添加了少量乙腈的样品定容液可以抑制微生物的生长，便于保存。因此，综合考虑溶解性、峰形和保存的状况，选择乙腈和水的混合溶剂（20∶80）作为溶剂较好。

2.2 不同前处理方法对同一阳性样品测定结果的影响

分别采用4种不同的处理方法对同一阳性样品中的氯霉素进行测定，测定结果见表3。

由表3可知，方法A、C测定结果基本一致，而方法B和D均未检出，说明不同前处理方法带来的最终结果可能会显著不同。

2.3 4种处理方法的加标回收率

为考察方法B、D测定结果是否由处理过程中的损失带来的，本研究做了4种方法的加标回收率试验。表4为采用不同处理方法的加标回收情况。

图1 氯霉素及D5－氯霉素标准品总离子流色谱图 （tr＝4.38 min）Figure 1 Total ion chromatogram of chloramphenicol and D5－chloramphenicol

表3 4种处理方法对同一阳性样品的测定结果Table 3 Testing result of four pretreatment method for the same positive sample（n ＝3）

表3 4种处理方法对同一阳性样品的测定结果Table 3 Testing result of four pretreatment method for the same positive sample（n ＝3）

未检出：＜0.1μg／kg。

方法测定值／（μg·kg－1）1 2 3平均值／（μg·kg－1） RSD／%A 1.48 1.44 1.52 1.48 1.9 B 未检出 未检出 未检出 未检出 ／C 1.31 1.42 1.47 1.40 5.6 D 未检出 未检出 未检出 未检出 ／

表4 4种不同前处理方法的加标回收率比较Table 4 Mean recoveries for chloramphenicol in milk powder at the level of 1.0μg／kg（n ＝3）

由表4可知，4种处理方法回收率并无显著差异。这说明表3的测定结果的差异并不是由样品处理过程中目标物的损失引起的，而是由提取效果的差异而产生的。这也表明良好的加标回收率并不代表此方法能准确测定样品中的某一组分。B、D法未能检出氯霉素的结果说明，氯霉素在乙腈和乙酸乙酯中的溶解性虽然很好，但可能由于奶粉不溶于乙腈和乙酸乙酯，导致溶剂无法与目标物接触，从而无法提取奶粉中的氯霉素。

2.4 两种定量方法测定结果的比较分析

将方法A处理的阳性样品分别用两种定量方法测定，结果及精密度见表5。

表5 内标法和外标法测定结果比较Table 5 Comparison of determination results of chloramphenicol between internal standard and external standard methods

由表5可知，内标法的精密度优于外标法，其测定结果高于外标法，原因有二：① 样品前处理造成目标物一定程度的损失，同位素内标法的校正因子可以校正这种损失，外标法无法校正这种损失；② 由于质谱定量分析的基质效应，相同浓度的样品基质目标物信号值低于纯标准溶液中目标物的信号值。而同位素内标法能很好地解决上述两个问题，因此，选择内标法定量测定奶粉中的氯霉素，其结果相对准确。

3 结论

本研究结果表明，加标回收率仅能体现试验过程的目标物损失情况，而并不能体现对样品中目标物的提取程度，但可为广大分析工作者提供一种快速测定奶粉中氯霉素含量的检测方法。该法用饱和氯化钠水溶解奶粉，并用乙腈漩涡震荡提取，内标法定量，可快速准确地测定奶粉中的氯霉素含量。

1 王花茹，王加才.骨髓造血机能的潜在杀手氯霉素残留危害及检测［J］.中国动物保健，2008（10）：43～44.

2 吴晓丰，杨露花.氯霉素残留的危害及检测方法［J］.动物医学进展，2004，25（3）：41～43.

3 李海平，张树海，张坤生.GC－MS法分析法在猪肉氯霉素残留检测中的应用［J］.食品与机械，2006，22（5）：89～92.

4 任佳，郑小平，黄菲菲，等.UPLC－MS／MS法测定乳制品中的氯霉素类药物［J］.食品与机械，2011，27（4）：75～77.

5 李丹妮，严凤，张文刚，等.超高效液相色谱三重四极杆质谱法对奶粉中氯霉素残留量的检测［J］.分析测试学报，2008（27）：161～163.

6 国家质量监督检验检疫总局.GB／T 22338－2008动物源食品中氯霉素类药物残留量的测定［S］.北京：中国标准出版社，2008.

7 国家质量监督检验检疫总局.SN／T 1864－2007进出口动物源食品中氯霉素残留量的检测方法 液相色谱－串联质谱法［S］.北京：中国标准出版社，2007.