不同纯化方法对花生多糖抗氧化活性的影响

刘光宪 冯健雄 王 辉

LIU Guang－xian 1，2 FENG Jian－xiong 1，2 WANG Hui 3

祝水兰1，2 周巾英1，2 付晓记1，2

ZHU Shui－lan 1，2 ZHOU Jin－ying 1，2 FU Xiao－ji 1，2

（1.江西省农业科学院，江西 南昌 330200；2.国家花生加工技术研发分中心，江西 南昌 330200；3.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

（1.Jiangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanchang，Jiangxi 330200，China；2.National R＆D Subcenter for Peanut Processing，Nanchang，Jiangxi 330200，China；3.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330047，China）

冷榨制油技术因其加工条件温和、蛋白变性程度低等优点越来越受到消费者及加工企业的关注［1］。冷榨花生饼是冷榨制油的主要副产物，近年来，冷榨花生饼的应用主要有制备小分子肽、提取高纯度蛋白粉、提取花生粗多糖及其功能特性的研究等［2－4］，但是多数研究是对花生中提取的粗多糖进行功能特性的研究，在花生多糖纯化及高纯度花生多糖的性质等领域的研究未见相关研究报道［5－7］。

人工合成的抗氧化剂如BHA和BHT等存在毒性和致癌性，其食用安全性备受关注，在食品加工中的应用受到了限制。近年来，植物抗氧化剂如多糖、酚类、抗氧化肽、植酸、花色苷色素等因具有安全、抗氧化活性强等优点而备受重视［8，9］，制备植物抗氧化剂，开展推广应用研究成为了热点。

本研究拟采用不同纯化方法分离纯化花生多糖，并考察不同纯度花生多糖的抗氧化活性，以期为花生多糖的分离纯化及应用提供指导。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料与试剂

冷榨花生饼粕：山东德州宏鑫花生蛋白有限公司；

葡萄糖、3，5－二硝基水杨酸、DEAE－52 Cellulose、Sephadex G－200：分析纯，美国Sigma公司；

耐高温α－淀粉酶：酶活力2万U／m L，美国Sigma公司；

糖化酶：酶活力10万U／m L，美国Sigma公司；

透析袋：截留分子量3 500，美国Sigma公司；

叠氮化钠、1，1－二苯基苦基苯肼（DPPH）、VC、邻苯三酚、水杨酸、双氧水、盐酸、对氨基苯磺酸、七水合硫酸亚铁、三羟甲基氨基甲烷、盐酸萘乙二胺：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器

紫外可见分光光度计：T6新世纪型，北京普析通用仪器有限责任公司；

台式离心机：TDL－5－A型，上海安亭科学仪器厂；

冷冻干燥机：LGJ－1型，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；

数显恒温水浴锅：HH－4型，常州国华电器有限公司；梯度混合器：TH－500A型，上海琪特分析仪器有限公司；

恒流泵：BT1－100E型，上海琪特分析仪器有限公司；

电脑全自动部分收集器：DBS－100－LCD型，上海琪特分析仪器有限公司；

酸度计：Delta 320型，梅特勒－托利多国际股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 多糖含量的测定 以葡萄糖为标准品，采用苯酚－硫酸法测定，经分析，回归方程为A ＝0.007 3x＋0.006 4（R2＝0.999 1）。 表明葡萄糖质量在16～72μg范围内，吸光值与葡萄糖含量呈良好的线性关系。

1.2.2 花生粗多糖的提取 参照文献［5］的方法提取花生多糖，醇沉、离心、冷冻干燥后得花生粗多糖，经测定花生多糖的含量为46.45%。

1.2.3 花生多糖的分离与纯化

（1）分离：参照文献［2］的方法采用双酶水解解法进行纯化，花生多糖提取溶液先后经耐高温α－淀粉酶、糖化酶处理，灭酶后离心、过滤收集上清液，冷冻干燥得PPS－a组分，经测定其花生多糖含量为78.12%。

（2）纯化：花生多糖提取液采用木瓜蛋白酶－TCA法［5］脱蛋白后，经DEAE－52纤维素离子交换柱层析纯化，经蒸馏水洗脱再用0.223 mol／L NaCl线性梯度洗脱，可得到两个主要的多糖组分PPS－1和PPS－2，其花生多糖的含量分别为17.79%和66.93%。

1.2.4 花生多糖的抗氧化活性测定方法 以PPS－a、PPS－2为原料，以VC为对照，研究其抗氧化活性。

（1）羟自由基（·OH）的测定：参照文献［10］。

（3）DPPH自由基清除活性的测定：参照文献［12］。

（4）抗脂质过氧化能力的测定：参照文献［13～16］。

2 结果与分析

2.1 花生多糖清除羟自由基（·OH）的能力

由图1可知，两种花生多糖提取物对·OH自由基均具有清除作用，在浓度为1.0～6.0 mg／m L时，抑制率随浓度的增加而增强，经测定清除羟自由基的半抑制浓度（IC50）分别是3.51，4.47 mg／m L，PPS－a对·OH 的清除活性高于PPS－2，并与VC（IC50＝4.49 mg／m L）处于同一水平。但在浓度大于5 mg／m L时，两种多糖的活性均高于VC，PPS－a组分清除·OH自由基的能力大于PPS－2组分。

图1 多糖溶液对·OH自由基的清除效果Figure 1 ·OH radical scavenging activity of the polysaccharides solutions

2.2 花生多糖清除超氧阴离子自由基（O·）的能力

由图2可知，花生多糖提取物（PPS－a、PPS－2）对O·都具有清除作用，且抑制率随着浓度的升高而增大，通过测定其消除超氧阴离子自由基的半抑制浓度（IC50）分别是3.02，7.31 mg／m L，表明多糖组分PPS－a清除O·的活性高于PPS－2组分。但与VC相比多糖的抗氧化活性较低。

图2 多糖溶液对O的清除效果Figure 2 O·radical scavenging activity of the polysaccharides solutions

2.3 花生多糖清除DPPH·自由基的能力

由图3可知，两组花生多糖均具有清除DPPH·自由基的能力，清除活力随花生多糖浓度的增加而增强，花生多糖PPS－a清除DPPH·能力高于多糖PPS－2组分。当PPS－a的浓度为1.0 mg／mL时，其对DPPH·的清除率可达56.19%。经测定，这两个多糖组分的IC50值分别为0.856，1.697 mg／m L，PPS－a组分清除DPPH·自由基的能力大于PPS－2组分。与VC相比多糖的抗氧化活性较低。

图3 多糖溶液对DPPH·的清除效果Figure 3 DPPH radical scavenging activity of the polysaccharides solutions

2.4 花生多糖还原力

由图4可知，花生多糖（PPS－a、PPS－2）均具有还原能力，且随多糖浓度的增大而增强，在浓度为8 mg／m L时，OD值分别为0.378和0.476，而VC的OD值为2.50，由此可看出花生多糖的还原能力约为VC的16%左右，PPS－a组分还原能力大于PPS－2组分。

图4 花生多糖的还原力Figure 4 Reducing power of the polysaccharides solutions

2.5 花生多糖抗脂质过氧化能力

由图5可知，在浓度为0～10 mg／m L时，花生多糖（PPS－a、PPS－2）抗脂质过氧化能力随浓度的增加而增强，经测定在10 mg／m L浓度时，抑制率分别为73.09%和56.86%，计算得出IC50分别为7.69，7.98 mg／m L，表明花生多糖PPS－a的抗脂质过氧化能力较高，但都不如VC。

3 结论

采用双酶（耐高温α－淀粉酶、糖化酶）水解纯化得到的花生多糖其抗氧化活性较DEAE－52纤维素柱层析法得到的花生多糖强；采用双酶水解法纯化多糖类物质，通过酶的专一性、高效性能有效实现杂质的分解去除，进而提高多糖的纯度；但两种纯化方法得到的花生多糖的结构差异及其对抗氧化活性的影响仍需要进一步研究。

图5 多糖抗脂质过氧化能力Figure 5 Anti－lipid peroxidation activity of the polysaccharides solutions

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