虫草多糖微波辅助提取工艺的优化

岳 春 李靖靖 方永远

YUE Chun 1 LI Jing－jing 2 FANG Yong－yuan 1

（1.南阳理工学院生化学院，河南 南阳 473000；2.中州大学化工食品学院，河南 郑州 450044）

（1.School of Biotechnology，Nanyang Institute of Technology，Nanyang，Henan 473004，China；2.Chemistry Engineering and Food Experiment Administrative Center Institute of Zhongzhou University，Zhengzhou，Henan 450000，China）

虫草多糖为蛹虫草的重要活性成分，是由甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖等组成的多聚糖，具有提高免疫、抗衰老、抗肿瘤、降血脂、抗动脉粥样硬化、保肝、耐缺氧、镇静等作用［1］。目前对虫草多糖的提取主要采用水热回流法、超声波浸提法、超临界萃取法［2］等，然而水热回流提取法虽然有利于虫草多糖的提取，但耗时过长；超声波提取法具有加速植物中有效成分进入溶剂，增加提取率等诸多有利因素，但在试验中由于多糖提取温度是主要影响因子，而超声波所产生温度仅能达到50℃左右，这不利于多糖溶解［2］；超临界萃取法所需的设备要求比较高而且萃取率较低。所以寻求一种高效、快捷的方法变得迫切需要。

微波辅助萃取技术是近年来新发展起来的一种方法，具有穿透性强、选择性高、加热效率高等特点，在接近环境温度下抽提所需的有效成分，对热敏性成分的浸提极为有效。微波技术应用于植物细胞破壁，能有效提高得率，已被广泛应用于各种天然活性成分的提取［3］。

本研究拟将微波辅助提取技术应用于虫草多糖的提取工艺研究，通过响应曲面法设计试验［4］，探求微波辅助提取虫草多糖的最佳工艺条件，在充分利用蛹虫草资源的基础上，为虫草多糖的进一步开发利用提供有力的保障。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

蛹虫草：由南阳理工学院生化学院食品实验室提供；

浓硫酸：东莞市力冠化工有限公司；

95%乙醇：广州万从化工有限公司；

无水葡萄糖：北京鹏彩精细化工有限公司；

丙酮：南京化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

高速万能粉碎机：FW－200型，北京中兴伟业仪器有限公司；

电热恒温水浴锅：DK－98－1型，天津市泰斯特仪器有限公司；

电子天平：BS100S型，北京赛多利斯天平有限公司；

旋转蒸发器：RE－201D型，巩义市英峪予华仪器厂；

循环水式真空泵：SHZ－D（Ⅲ）型，巩义市英峪予华仪器厂；

低速大容量离心机：TDL－40B型，上海安亭科学仪器厂；

电热鼓风干燥箱：101－2A型，天津市泰斯特仪器有限公司；

752紫外分光光度计：WF2－2000型，上海龙尼柯仪器有限公司；

微波辅助反应仪：XH－MC－1型，北京祥鹄科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

蛹虫草→干燥→粉碎→脱脂→浸泡→微波辅助提取→离心→真空浓缩→醇沉→静置→脱蛋白→沉淀→烘干（50～60℃）→粗多糖→溶解（20～25倍体积的水）→脱色→离心→浓缩→醇沉→沉淀→真空干燥→精制虫草多糖

1.3.2 操作要点

（1）粉碎：取蛹虫草烘干粉碎后过80目筛。

（2）脱脂：采用石油醚脱脂，按虫草粉∶石油醚＝1∶5（m∶V），回流1～2 h。

（3）微波辅助提取：确定好所需的功率、时间、料水比后，辐射1 min，间隔1 min后再辐射1 min，如此间隔辐射直至总辐射时间达到所需要的时间（浸提温度60～80℃，时间30 min），过滤，然后按同样条件重复提取一次。

（4）醇沉：浓缩液冷却后，加入3倍量95%乙醇使其沉淀，取出上清液，沉淀再用少量水溶解，重复2次，之后静置8～24 h。

（5）脱蛋白：采用Sevage法。Sevage试剂：氯仿（三氯甲烷）∶正丁醇＝5∶1；利用蛋白质在三氯甲烷等有机溶剂中变性的特点，将提取液与Sevage试剂5∶1混合，振荡离心，变性后的蛋白质介于提取液与Sevage试剂交界处。弃最下面的氯仿层以及中间的蛋白层，留上层水液（正丁醇密度最小，用量也是最小，飘在水液上面，暂时忽略它），然后再进行浓缩和多次醇沉后并用无水乙醇、丙酮和无水乙醚进行多次洗涤［5］。

（6）脱色：将活性碳与含虫草多糖的溶液按固液比1∶5（m∶V）混匀，放置摇床上振摇3 h后取下，过滤除色素。

1.3.3 单因素试验设计 每次精确称取5.0 g蛹虫草粉，分别按照不同的微波功率、微波处理时间、料水比、提取次数进行处理，以多糖产率为评价指标确定各因素的最佳取值范围。各单因素试验的设计：

（1）微波功率对多糖产率的影响：固定料水比1∶30（m∶V），微波处理时间4 min，提取2次。微波功率分别取300，400，500，600，700 W。

（2）料水比对多糖产率的影响：固定微波功率500 W，处理时间4 min，提取2次。料水比分别取1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40（m∶V）。

（3）微波处理时间对多糖产率的影响：固定微波功率500 W，料水比1∶35（m∶V），提取2次。微波处理时间分别取2，3，4，5，6 min。

（4）提取次数对多糖产率的影响：固定微波功率500 W，料水比1∶35（m∶V），微波处理时间4 min。分别提取1，2，3次。

1.3.4 响应曲面法试验设计 本试验在单因素试验结果的基础上，采用中心组合试验Box－Behnken设计方案，以微波功率、料水比及微波处理时间为自变量，虫草多糖得率为响应值，对虫草多糖的微波辅助提取工艺进行优化。

1.3.5 虫草多糖含量的测定 采用硫酸－苯酚法。标准曲线的制备：精密称取0.100 8 g于105℃下干燥至恒重的葡萄糖，置1 000 m L容量瓶中，加适量蒸馏水稀释至刻度，则质量浓度为0.100 8 mg／m L。再分别精密吸取5，10，15，20，25，30 m L于50 m L容量瓶中，定容至刻度，再分别吸取2.0 m L于6个比色管中；各加入6%苯酚溶液1.0 m L，混匀，迅速加入浓硫酸5.0 m L，混匀，沸水浴15 min后，冷却至室温，以蒸馏水为空白处理，于490 nm处测定吸光值［5］，并绘制葡萄糖标准曲线（图1），得方程为y ＝7.957 1x－0.010 3，R2＝0.998 4。

图1 葡萄糖的标准曲线方程Figure 1 The standard curve equation of glucose

1.3.6 虫草多糖产率的测定 虫草多糖产率按式（1）计算：

式中：

Y—— 虫草多糖产率，%；

C——吸光值对应的标准曲线上的葡萄糖浓度，mg／m L；

V——测定液的体积，m L；

f—— 稀释倍数；

W——试验所取的蛹虫草粉的质量，g。

2 结果与分析

2.1 中心组合试验设计方案及结果

根据单因素试验结果，确定微波辅助提取的次数为2，并且得出微波功率、料水比和微波处理时间的因素水平取值范围见表1。根据中心组合试验设计设计的方案及试验结果见表2。

表1 响应面分析试验因素与水平Table 1 Factors and levels in the response surface design

表2 Box－Behnken试验设计方案及结果Table 2 Box－Behnken design and results

2.2 模型的建立及显著性检验

利用 Design－Expert（version7.1.6）软件对表2的试验数据进行多元回归拟合，得到虫草多糖产率（Y）对微波功率、水料比、微波处理时间的二次多项回归模型为

Y ＝11.91＋0.83A＋0.7B＋0.5C＋0.02AB－1.31AC＋0.06BC－1.15A2－0.83B2－0.56C2（2）

由表3可知，模型 P ＝0.000 2＜0.01，表明 Quadratic回归方差模型是高度显著的；失拟项P＝0.119 3＞0.05，表明失拟不显著。模型的调整确定系数R2Adj＝0.973 5，说明该模型能够解释97.35%的响应值变化。因此，该模型拟合程度良好，试验误差小，可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析和预测［6］。

2.3 响应面图分析及结果

2.3.1 微波功率与水料比对虫草多糖产率影响的响应面图

由图2可知，当微波处理时间固定为4 min时，微波功率和水料比的交互作用对多糖产率影响不显著（P＝0.875 5）。从微波功率曲面斜率大于水料比曲面的斜率可知，微波功率对于虫草多糖产率的影响大于水料比对多糖产率的影响。当微波功率为500～550 W，料水比为1∶35～1∶38（m∶V）时，多糖的产率较高。

表3 二次回归模型的响应面方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

图2 微波功率与水料比交互作用的响应面图Figure 2 Response surface of microwave power and water to material ratio

2.3.2 微波功率和微波处理时间对虫草多糖产率影响的响应面图 由图3可知，当料水比固定为1∶35（m∶V）时，微波功率和处理时间交互作用的等高线呈椭圆形，说明二者交互作用极为显著。所以一定要控制好微波功率和提取时间，才能有较高的提取率。当微波功率为500～550 W，处理时间为3.5～4.5 min时，多糖的产率较高。

图3 微波功率与微波处理时间交互作用的响应面图Figure 3 Response surface of microwave power and microwave treatment time

2.3.3 水料比和微波处理时间对虫草多糖得率的影响 由图4可知，当微波功率固定为500 W时，水料比和微波处理时间的交互作用等高线图趋于圆形，则两者的交互作用不显著。当微波处理时间很小时，多糖得率普遍较低，这可能是时间短时，细胞的破壁效果不是很好，导致多糖的溶出率很低，相反，处理时间过长，多糖水解程度加大，导致多糖的得率下降，所以选择合适的处理时间也是至关重要的。综上述，当料水比在1∶36～1∶37.5（m∶V），处理时间在4.5 min左右时虫草多糖有较高的产率。

通过利用 Design Expert（version 7.1.6）软件以响应值（多糖的产率）进行优化分析，得到虫草多糖提取的最佳条件为微波功率533.8W，料水比1∶36.73（m∶V），微波处理时间4 min，在此条件下多糖的产率理论值为12.21%。为检验响应面分析法所得结果的可靠性，采用上述优化提取条件进行虫草多糖的提取，考虑到实际操作的便利，将提取工艺参数修正为微波功率534 W，料水比1∶37（m∶V），处理时间4 min，提取次数2次。在最佳工艺条件下进行5次平行实验，多糖得率平均值为12.10%，回归方程所得多糖得率预测值为12.21%，则两者之间产生的相对误差为0.9%，说明回归方程能较真实地反映各因素对虫草多糖得率的影响，也有力地说明了响应面法在提高虫草多糖产率方面回归模型较可靠。

图4 水料比和微波处理时间交互作用的响应面图Figure 4 Response surface of water to materials ratio and microwave treatment time

3 结论

采用响应面分析法研究了虫草多糖的微波辅助提取工艺，建立了虫草多糖产率的二次回归方程，经验证该模型极为显著，可用来预测响应值的变化，通过响应面分析得到优化后的最佳提取工艺条件为微波功率534 W、提取时间4 min、料水比1∶37（m∶V），提取次数2次，该条件下多糖提取率为12.10%，与传统的水热回流法提取虫草多糖的得率4.18%［2］来说大大提高了多糖的得率。

1 邓黎，周同永，韩涛，等.响应曲面法对蛹虫草多糖超声提取工艺的优化效果［J］.贵州农业科学，2012，40（8）：187～190.

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3 马长雨，杨悦武.微波萃取在中药提取和分析中的应用 ［J］.中草药，2004，35（11）：7～10.

4 单斌，张卫国，谢建华，等.响应面法优化超声辅助提取苦瓜多糖工艺的研究［J］.食品与机械，2009，25（1）：76～80.

5 刘玲，安家彦，金凤燮.蛹虫草多糖除杂蛋白的方法［J］.大连轻工业学院学报，2002，21（1）33～37.

6 毕春慧，莲清.响应面分析法优化雷丸多糖提取工艺的研究［J］.食品科技，2010，35（8）：217～221.