稳斑汤对ApoE基因敲除小鼠主动脉粥样硬化不稳定斑块HSP70表达的影响*

颜晓睿 宫丽鸿

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

稳斑汤对ApoE基因敲除小鼠主动脉粥样硬化不稳定斑块HSP70表达的影响*

颜晓睿1宫丽鸿2△

（1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110032；2.辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 110032）

目的 观察搜风祛痰法中药复方稳斑汤对ApoE基因敲除小鼠主动脉粥样硬化（AS）不稳定斑块HSP70表达的影响。方法 ApoE基因敲除小鼠高质饮食喂养13周后，待其形成成熟的AS斑块，随机分为模型组、稳斑汤低剂量组、稳斑汤中剂量组、稳斑汤高剂量组、西药组、空白对照组。各组相应处理13周后，取主动脉组织HE染色后在光学显微镜下进行病理学观察，然后采用免疫组化和RT-PCR技术检测HSP70的表达水平。结果 治疗组主动脉组织中HSP70表达水平高于对照组（P＜0.05或P＜0.01），稳斑汤高剂量组HSP70表达水平与西药组无明显差异（P＞0.05）。结论 捜风祛痰中药复方稳斑汤可通过影响HSP70以稳定易损斑块，其机制可能与HSP70对心血管系统的保护作用相关。

搜风祛痰法 复方稳斑汤 ApoE基因敲除小鼠 动脉粥样硬化不稳定斑块 HSP70

近年来，由心血管事件引发的死亡率已超过感染性疾病跃居第一位，预计到2020年，每年将有2.5亿人患有心血管疾病，而其中1/3的人将死于急性冠脉综合征（ACS）［1］。研究表明，炎症启动灌装动脉粥样硬化的发生并影响其进程，使AS斑块变得不稳定，引起ACS。斑块内炎症反应、全身性炎症反应以及感染均可影响斑块的稳定性［2］。热休克蛋白（HSP），也称应激蛋白，是一类在结构上高度保守的蛋白，广泛存在于原核生物和真核生物中［3］。研究发现，HSP70无论在正常还是在应激情况下，对细胞的蛋白合成均发挥重要作用，尤其在心肌缺血过程中，不仅是细胞受损的标志，也是细胞的保护因子。HSP70在细胞内过量表达对一定时间内的严重心肌缺血有保护作用［4］。本研究旨在观察捜风祛痰中药复方稳斑汤对ApoE基因敲除小鼠主动脉粥样硬化不稳定斑块内HSP70表达的影响。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 6～8周龄ApoE基因缺陷鼠（系C57BL/6J，北京大学实验动物中心美国Jackson实验室引进并培育成功）70只，SPF级，体质量18～20g。

1.2 药物与试剂 药物为稳斑汤，组成为全蝎5g，蜈蚣2g，地龙15g，陈皮15g，半夏15g，白术15g，水蛭15g。由辽宁中医药大学附属医院提供，加工制成含生药2g/mL的中药浓缩液备用。相关抗体（北京博奥森生物科技有限公司）。SP试剂盒（北京博奥森生物科技有限公司）。DAB显色试剂盒（北京博奥森生物科技有限公司）。两步法RT-PCR试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）。

1.3 实验方法 （1）造模。小鼠予高脂饲料喂养13周后，随机处死4只，取主动脉根部，HE染色观察AS硬化程度，确定造模成功。（2）分组及中药干预。ApoE基因敲除小鼠60只随机分为5组每组12只：模型组、稳斑汤低剂量组、稳斑汤中剂量组、稳斑汤高剂量组及西药组。根据成人每日用药临床推荐的常用剂量，按成人与小鼠的体质量折算系数9.0折算成小鼠用量，稳斑汤低剂量组：61.75g/（kg·d），稳斑汤中剂量组123.5g/（kg·d），稳斑汤高剂量组247g/（kg·d），西药组0.27g/（kg·d），模型组给予0.9％氯化钠注射液0.3mL/d。按体质量系数比折算成小鼠用量灌胃给药，每日1次。正常C57BL/6J小鼠12只正常饲料喂养13周，设为空白对照组。 取材前夜禁食，经小鼠眼眶静脉丛采血，离心分离血清，-80℃冻存，用作测定血清HSP70水平。处死全部小鼠，无菌条件下取出心脏及主动脉，心脏10％甲醛固定，主动脉放在冻存管内液氮骤冷保存。

1.4 检测方法 （1）主动脉组织病理学观察。每组随机取5只小鼠，麻醉处死，无菌条件下在每只小鼠的主动脉根部取4个相同的切面，分别为：①升主动脉最近端横截面，切面形态呈圆形；②主动脉瓣附着部位，并有冠状动脉开口；③主动脉瓣起始横截面；④主动脉瓣完全出现并汇合在一起，0.9％氯化钠注射液冲洗，10％甲醛中性溶液固定。常规石蜡包埋，均匀间断切片，厚5μm。HE染色，普通光镜下观察主动脉根部组织及斑块的形态结构；Masson染色，普通光镜下观察各斑块中纤维成分的分布。用计算机彩色图像处理系统测量血管内膜厚度，斑块面积，管腔面积，脂质核心面积，斑块中除胶原和纤维成分以外的斑块面积，最小纤维帽厚度。（2）免疫组织化学检测。采用SP法，常规滴加一抗，二抗，DAB显色苏木精复染，高倍视野下计数浸润于内膜的单核细胞数。以染色系数统计HSP70免疫组化染色结果。（3）实时定量RT-PCR检测。先提取总RNA，然后取4μL总RNA经反转录酶及随机引物等反应物混合配成20μL体系，42℃15min，95℃，2min反转录成cDNA，随后进行实时荧光定量PCR反应，分别对小鼠HSP70的表达进行测定。

1.4 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件分析。计量资料数据以（±s）表示。组间比较用t检验，多组均数比较用方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 形态学改变 各组小鼠主动脉HE染色形态学改变如下。空白对照组：动脉内膜附有一层内皮细胞，内皮细胞层呈现皱褶状排列，但排列均匀，表面光滑，未见泡沫细胞及炎性细胞（图1A）。模型组：血管腔内可见明显的粥样硬化斑块出现，斑块表面附有纤维帽，纤维帽主要由平滑肌细胞、弹力纤维和胶原组织构成，斑块中央可见大量的脂质聚集，斑块内可见大量泡沫细胞，偶见炎性细胞浸润。未出现斑块的动脉内膜区域严重破损（图1B）。稳斑汤低剂量组：血管腔内可见粥样硬化斑块，斑块面积明显小于模型对照组，斑块内脂质含量较模型组少，斑块内可见少量泡沫细胞及炎性细胞。未出现斑块的动脉内膜区域形态较为完整，偶见内膜残缺（图1C）。稳斑汤中剂量组（图1D）、稳斑汤高剂量（图1E）、西药组（图1F）：动脉内膜大部分较为光滑，偶见内膜不全，内膜不全区域可见明显的脂质条纹块形成，偶见泡沫细胞聚集，有少量纤维成分交联（见图1）。

图1 光镜下各组小鼠腹主动脉根部组织及斑块的形态结构改变（HE染色，×100）

2.2 免疫组化 各组小鼠腹主动脉组织中HSP70主要表达于细胞浆中，阳性表达产物呈棕褐色颗粒，粥样硬化斑块中主要表达于纤维帽的平滑肌细胞胞浆中。空白对照组小鼠动脉内膜细胞胞浆内可见大量阳性表达颗粒（见图2A），模型组小鼠动脉组织切片中阳性表达物明显减少（见图2B），各治疗组表达水平高于模型组（见图2）。

图2 高倍视野下以染色系数统计HSP70免疫组化染色结果（DAB显色，×100）

2.3 各组小鼠腹主动脉组织中HSP70表达水平 见表1、表2、图3。给药13周后，在斑块内HSP70表达水平方面，稳斑汤各剂量组与西药组较模型组明显增高（P＜0.05），与空白对照组比较明显增高（P＜0.01），稳斑汤高剂量组与西药组较模型组明显增高（P＜0.01），稳斑汤高剂量组与西药组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 各组小鼠腹主动脉组织中HSP70蛋白表达水平（±s）

表1 各组小鼠腹主动脉组织中HSP70蛋白表达水平（±s）

与空白对照组比较，*P＜0.01；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

组 别 n空白对照组 10模型组 10稳斑汤中药低剂量组 10 HSP70表达水平0.201±0.013 0.169±0.009*0.210±0.011*稳斑汤中药中剂量组 10 0.219±0.014*△稳斑汤中药高剂量组 10 0.246±0.006*△△西药组 10 0.242±0.015*△△

表2 各组小鼠腹主动脉组织中HSP70mRNA表达水平（±s）

表2 各组小鼠腹主动脉组织中HSP70mRNA表达水平（±s）

组 别 n空白对照组 10模型组 10稳斑汤中药低剂量组 10 HSP70 mRNA表达水平0.291±0.030 0.233±0.028*0.285±0.028△稳斑汤中药中剂量组 10 0.343±0.020*△稳斑汤中药高剂量组 10 0.382±0.012*△西药组 10 0.413±0.021*△

图3 各组小鼠腹主动脉组织中HSP70mRNA表达电泳图

3 讨论

AS是一个复杂的病理进展过程，其发病机制至今尚未完全明了，目前多认为AS是一个炎症过程［5］，与内皮细胞受损、平滑肌细胞增殖［6］、炎症细胞浸润等因素密切相关。局部炎症细胞的浸润以及全身性炎症是导致易损斑块溃疡、破裂导致血栓形成，是临床ACS的主要病理学基础［7］。而斑块破裂是导致ACS的主要原因，因此稳定易损斑块为当今医学领域的研究重点。

HSP70是主要的伴侣蛋白，发挥“分子伴侣”作用，促进新生多肽链的正常折叠，协助新生蛋白质的合成和修复损伤的蛋白质，维持蛋白质合理构象；对分子重排、蛋白质集聚和新生多肽的跨膜转运具有辅助作用，减少细胞凋亡，修复离子通道；激活某些酶的作用以保护细胞的生成与功能［3］，对心肌细胞有强大的保护作用。

ACS属中医学“胸痹”、“真心痛”的范畴，为本虚标实之证，本虚多为气虚，标实则为血瘀、痰浊。痰瘀互结，日久蕴热，热极生风相互促生，日久不化，酿成浊脂，浸于脉管，诱发机体炎症反应，使AS形成不断增大甚至破裂；痰为百病之崇，风为百病之长，善行而数变，故发为不稳定型心绞痛或心肌梗死，因此可应用搜风祛痰中药稳定粥样硬化斑块。药理研究显示，全蝎能够增强心肌收缩力、扩张血管、降低血压、抗血栓形成；蜈蚣能抗心肌缺血、扩张血管、增强心肌收缩力；地龙能激活纤溶酶原；陈皮能抑制血小板聚集，降低血脂，降低血液高凝状态，预防动脉粥样硬化；水蛭能抗血栓形成，降低血液黏稠度，调血脂，防止动脉粥样硬化，而实验结果表明稳斑汤能明显提高HSP70的表达，从而保护心血管系统并稳定易损斑块。

综上所述，稳斑汤在临床推荐剂量上可通过影响HSP70的表达来稳定易损斑块，其机制与HSP70对心血管系统的保护作用有关，且疗效与西药阿托伐他汀无明显差异，毒副作用较小，具有一定的经济价值和社会价值。

［1］Geneva.World Health Report 2002：Reducing risks，promot-ing healthy life［J］.World Health Organization，2002，35（2）：87.

［2］周明学，徐浩，潘琳，等.活血、益气、化痰中药对ApoE基因敲除小鼠主动脉粥样硬化斑块炎症反应的影响［J］.中国中医急症，2008，17（4）：496-498.

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［4］李萍，富青，熊凡.热休克蛋白70及其在心肌保护中的作用［J］.医学综述，2004，10（2）：94-96.

［5］Ross R.Cell biology of atherosclerosis［J］.Ann Rev Physiol，1995，57（9）：791-795.

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Effect of Stablizing Plaque Decoction on Unstable Plaque HSP70（Heat Shock Protein 70）Expression of ApoE Knockout Rats with AS

YAN Xiaorui，GONG Lihong.
Liaoning Traditional Chinese Medical University，Liaoning，Shengyang 110032，China

Objective：To explore the effect of compound stablizing plaque decoction on unstable plaque HSP70（Heat Shock Protein 70）expression of ApoE knockout rats with AS.Methods：70 ApoE knockout mice were fed a high-fat diet for 13 weeks until the mature atherosclerotic plaques were formed.Thereafter，they were randomly divided into the model group，low-dose，medium-dose，high-dose of stabilizing plaque decoction groups，western medicine control group，and normal group.After 13 weeks，aortic tissues of each group were fetched to observe under an optical microscope after HE staining.And then immunohistochemical methods and RT-PCR technique were used to detect the level of HSP70 expression.Results：The HSP70 expression levels in aortic tissue of mice in the treatment groups were higher than control group（P＜0.05或P＜0.01），and the expression levels of HSP70 between TCM high-dose group and western medicine group had no significant differences（P＞0.05）.Conclusion：Searching wind and eliminating phlegm compound stabilizing plaque decoction may stabilize plaques by influencing the HSP70，and its mechanism may be associated with its protection for the cardiovascular system.

Searching wind and eliminating phlegm method；Compound stabilizing plaque decoction；ApoE knockout mice；AS unstable plaque；HSP70

R285.5

A

1004-745X（2014）10-1782-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.10.004

2014-06-21）

中国博士后面上项目（No.20110491540）；辽宁省百千万人才项目（No.2011921022）

△通信作者