长孢被孢霉利用淀粉质原料发酵产微生物油脂

赖 婧，张 波，姚日生，3

(1.合肥工业大学 医学工程学院，合肥 230009;2.合肥工业大学 化学工程学院，合肥 230009;3.农产品生物化工教育部工程研究中心，合肥 230009)

脂肪酸是重要的有机化工和精细化工原料，以脂肪酸为原料生产的下游衍生物广泛应用于纺织印染、食品、医药、日用化工、石油化工和橡塑加工等许多领域。目前，世界脂肪酸的主要来源是从天然动植物油脂经水解、精馏得到［1］。

微生物油脂，又称单细胞油脂(single cell oil，SCO)，是指由微生物在一定条件下将碳水化合物、碳氢化合物等基质转化为菌体内大量贮存的油脂［2－4］。与生产动、植物油脂相比，微生物油脂的生产有许多优点［5］:微生物细胞增殖快，生产周期短;生长所需的原料丰富，价格便宜;所需劳动力少，不受季节、气候变化的限制;能连续大规模生产，生产成本低等。因此，利用微生物发酵方法，把一些廉价易得的农副产品及食品工业的废弃物转化为所需油脂已日益成为许多研究者关注的热点［6－7］。

目前，微生物利用淀粉质原料产油脂的一般过程为先将淀粉水解成糖再发酵产油脂，其中淀粉的水解通常采用双酶法［8］，在此期间需经过2次pH调节，过程复杂、繁琐;而本研究采用实验室自筛的长孢被孢霉(M.elongate)可直接利用淀粉质原料。针对M.elongate的这一特性，对其发酵过程进行研究可使微生物发酵产油脂这一过程大为简化。

笔者对长孢被孢霉利用淀粉质原料发酵过程进行研究，并重点研究补料发酵方案，以期提高微生物油脂的生产利用率。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌种

M.elongate PFY，合肥工业大学久易化工研究所自筛;4℃保藏于斜面培养基。

1.1.2 培养基

菌种活化培养基:马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。

种子培养基(g/L):葡萄糖 30、酵母膏 8、K2HPO40.5、ZnSO40.5、MgSO40.5。

发酵培养基(g/L):可溶性淀粉(待考察)、玉米浆(待考察)、K2HPO40.5、ZnSO40.5、MgSO40.5。

1.1.3 主要试剂

所用玉米浆为市售;酵母膏，北京奥博星生物技术有限责任公司;其他试剂均为分析级。

1.2 实验方法

1.2.1 菌体培养

种子培养:将活化后的菌体挑取2环接种到100 mL灭菌种子培养基中，置250 mL摇瓶，于28℃、150 r/min转速下培养24 h。

发酵培养:取培养24 h的种子，按2%的接种量接种到100 mL灭菌发酵培养基中，置250 mL摇瓶，于28℃、150 r/min转速下，培养一定时间，定时取样，测定其油脂含量。

1.2.2 菌体生物量的测定

采用细胞干质量［9］(dry cell weight，DCW)法测定菌体生物量。发酵液过滤、洗涤，得到的细胞于60℃下烘干至恒质量后称质量，以干菌体质量浓度ρ(DCW)(g/L)表示。

1.2.3 残糖浓度的测定

发酵液过滤后，滤液进行适当稀释，采用蒽酮比色法测定发酵液中总糖残余量［10］。

1.2.4 菌体内油脂含量的测定及成分分析

选用索氏提取法测定油脂含量［11］:采用沸程30～60℃的石油醚提取干菌体内的油脂，并于90℃下烘干残余的石油醚，测定油脂质量。油脂含量以菌体内油脂量占菌体干质量的百分数表示，按式(1)计算。

采用GC-MS法分析油脂成分［12］:将油脂进行甲酯化后进行GC-MS分析，测定其中饱和与不饱和脂肪酸的比例。

2 结果与讨论

2.1 油脂成分分析

对发酵所得微生物油脂进行甲酯化处理后进行GC-MS分析，结果显示该微生物油脂中含有多种脂肪酸组分，其主要成分含量(质量分数):硬脂酸39.90%，油酸31.70%和亚油酸27.30%。

2.2 可溶性淀粉浓度对发酵产油脂的影响

在维持发酵培养基碳氮比不变的前提下，考察可溶性淀粉质量浓度对发酵产油脂的影响，结果见图1。

图1 C源对微生物油脂产量的影响Fig.1 Effects of soluble starch concentration on lipid production

由图1可以看出，C源的用量对菌体发酵产油脂的影响较大。随着可溶性淀粉浓度的增大，菌体干质量不断增加;而油脂产量则出现先升高后降低的趋势，并在可溶性淀粉质量浓度为20 g/L时达最大，为198.21 mg/L，且此时底物利用率最高，达0.99%。这是由于当底物浓度较低时，发酵过程中供能不足，菌种长势不良，使油脂合成受影响;当底物浓度过高时，菌株长势较旺，种群密度过大，造成发酵后期体系溶氧不足，影响油脂合成。

2.3 玉米浆浓度对发酵产油脂的影响

固定可溶性淀粉质量浓度20 g/L，考察不同玉米浆质量浓度对发酵产油脂的影响，结果见图2。

图2 玉米浆对微生物油脂产量的影响Fig.2 Effects of corn syrup concentration on lipid production

由图2可以看出:由于N源对菌体生长有促进作用，随着玉米浆浓度的升高，生物量不断增加，但油脂含量则呈现先升高后降低的趋势，并于玉米浆质量浓度为3 g/L时达最大，为278.39 mg/L，且此时底物利用率最高，为1.39%。这是由于在碳氮比低的情况下更有利于菌体的生长和生物量的提高。随着碳氮比的增加，C源和N源优先用于菌体生长，当N源耗尽后，N源成为限制性营养素，细胞不能再继续扩增，就把所吸收的C源物质转化成脂类物质，作为能源物质储存起来［13－14］。因此，当玉米浆浓度过低时，N源消耗过快，菌体长势不佳，影响油脂合成;当玉米浆浓度过高时，C源和N源被优先用于菌体生长，油脂产量下降。

2.4 发酵特性曲线

在20 g/L可溶性淀粉、3 g/L玉米浆的条件下，监测发酵7 d内的菌体生物量(以菌体干质量表示)、油脂含量、残糖浓度和pH变化，结果见图3～图4。

由图3可知:随着发酵的进行，菌体浓度和油脂产量不断增加，糖浓度不断降低，至发酵第5天，菌体生物量和油脂产量达最大，且培养基中的C源基本耗尽，残糖质量浓度仅为2 g/L;此后，菌体细胞进入饥饿状态，制约生长甚至自溶，造成菌体干质量和油脂产量下降，残糖浓度趋于不变。因此，可确定单批发酵的最适发酵时间为120 h。

图3 发酵特性曲线Fig.3 Biomass variation with fermentation process

图4 pH随发酵过程的变化Fig.4 Effects of fermentation process on pH

由图4可知:随着发酵的进行，体系pH呈现先降低后升高的趋势，且在发酵48～96 h处有一平台期，此平台期也是油脂产量升高和残糖浓度降低最快的时期。造成这一现象的原因可能是:随着菌体细胞生长，发酵液中N源物质逐渐消耗，体系pH下降;当N源消耗殆尽时，菌体细胞开始油脂合成，体系pH基本维持不变;随着C源物质的进一步消耗，菌体细胞进入衰亡期，菌体自溶，一些胞内物质释放到发酵液中，使pH上升。因此，可通过监测体系pH变化，确定发酵结束时间。

2.5 补料发酵对发酵产油脂的影响

由菌体生物量和残糖浓度随发酵的变化曲线可看出，菌体在发酵48～96 h，底物利用速度较快，故分别选择发酵48、72和96 h作为补料开始的时间点，考察仅补C源和同时补加C源和N源对油脂产量的影响。即每隔24 h补料，补料3次，单次补料量为可溶性淀粉2 g，玉米浆补加量随C/N比变化，结果见图5。

图5 补料对微生物油脂产量的影响Fig.5 Effects of fed-batch on lipid yield

由图5可知:各种补料方案对油脂产量均较不补料组有大幅度提高，且以仅补C源组增幅最大。这是由于补充N源后，培养基中N源增加，C源和N源被优先用于菌体生长，随着N源逐渐被利用，N源成为限制性营养因素，这时，菌体才开始把所吸收的C源物质大部分转化成油脂。在发酵48 h和发酵72 h开始补料，油脂产量和底物利用率相差不大。发酵48 h开始补料，油脂产量最大为598.96 mg/L，底物利用率为2.3%;发酵72 h开始补料，油脂产量最大，为 611.63 mg/L，底物利用率为2.35%。但结合发酵周期及经济效益，发酵48 h开始补料发酵周期比发酵72 h开始补料发酵周期短，经济效益较大。因此，选择发酵48 h作为补料开始时间，且可监测发酵过程pH变化，在pH 2.5时开始补料。

在确定补料成分后，考察单次补料量对油脂产量的影响，结果见表1。

由表1可知:随着单次补料量的增加，油脂产量逐渐增加，直至单次补料量为4 g时，油脂产量最高，此后，随着单次补料量的进一步增加，油脂产量降低。这是由于补料量过大时，体系黏度较大，溶氧不足，影响油脂合成。因此单次补加4 g可溶性淀粉为最适补料量，此时底物利用率高，且油脂产量最大，油脂产量较不补料时增加521.74 mg，增长率为237.1%。

表1 补料浓度对微生物油脂产量的影响Table 1 Effects of feeding culture concentration on lipid yield

3 结论

通过研究得出如下结论:

1)发酵所得微生物油脂，其主要成分含量为硬脂酸39.90%，油酸31.70%和亚油酸27.30%。

2)单批发酵的最适可溶性淀粉为20 g/L，最适玉米浆为3 g/L;N源对菌体增长有促进作用。

3)油脂合成主要在发酵48～96 h进行，单批发酵最佳时间为5 d。

4)通过补料工艺研究可知，最适起始补料时间点为发酵48 h，最适单次补料量为4 g，此时，油脂产量可增加521.74 mg，增长率为237.1%。

通过研究表明，N源对菌株的生长有促进作用，N源浓度较大时，培养基中C源和N源优先用于菌体细胞生长，采用限氮补料工艺可大幅度提高微生物油脂的产量。发酵所得微生物油脂富含硬脂酸、油酸和亚油酸，均是重要的化工原料，可广泛应用于橡胶、医药和日用品等行业。

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