一株γ-多聚谷氨酸生产菌的分离筛选与鉴定

何 剑，雍晓雨，2，周 俊，2，王舒雅，2，陈怡露，郑 涛，2

(1.南京工业大学 生物与制药工程学院，南京 211800;2.南京工业大学 生物能源研究所，南京 211800)

γ-多聚谷氨酸(γ-polyglutamic acid，γ-PGA)是由微生物利用D-和/或L-型谷氨酸单体通过α-氨基和γ-羧基之间的酰胺键聚合而成的一种天然带负电和的高分子聚合物［1］，最先在炭疽芽胞杆菌的荚膜中发现［2］。到目前为止，已发现有多种生物在代谢过程中能够合成γ-PGA，包括古细菌(Natrialba aegyptiaca)、细菌(Bacillus subtilis natto、B.subtilis subsp.chungkonkjang、B.licheniformis ATCC9945、B.anthracis和 B.megaterium WH320)和 动 物(Hydra)［3］，其中以芽胞杆菌类最普遍。γ-PGA 及其衍生物在食品、化工、材料和医药等领域具有极大的开发价值和广阔的应用前景［4］。

γ-多聚谷氨酸结构独特，很难通过化学方法合成;酶转化法虽然工艺路线简单、周期短，但合成的γ-PGA相对分子质量较小，制约了该方法的生产实际应用;提取法制备γ-PGA的含量不稳定且副产物多、成本也较高，不利于大规模生产，因此目前获得γ-PGA最有效的途径是通过微生物发酵［5］。目前，用于研究 γ-多聚谷氨酸生产的典型菌株主要有 Bacillus licheniformis ATCC9945a(从土壤中分离得到)和Bacillus subtilis IFO3335(从豆制品中分离得到)等［6］。Jeong等［7］报道了 1 株B.subtilis RKY3经过24 h发酵，γ-PGA产量达到48.7 g/L，但相对分子质量仅为 6.2×104;Cao等［8］报道了 1 株 B.amyloliquefaciens LL3，虽经过44 h发酵生产的γ-PGA相对分子质量为4.7×105，但产量仅有4.4 g/L;由于菌株产率较低、营养条件要求苛刻，难以大规模生产，例如Ashiuchi等［9］发现 Bacillus subtilis subsp.chungkookjang 在含有200 g/L谷氨酸的培养基中培养5 d，γ-PGA的产量仅能达到13.5 g/L，因此，筛选优良的 γ-PGA生产菌种尤为重要［10］。本文旨在从土壤中自主分离出一株高产γ-PGA的菌种，为γ-PGA的应用提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 分离试样

土样采集自江苏省南京市玄武区某菜园土。

1.1.2 培养基

固体筛选培养基 (g/L):柠檬酸10、谷氨酸10、NH4Cl 6、K2HPO41、MgSO4·7H2O 0.5、FeCl3·6H2O 0.02、CaCl20.2、MnSO4·H2O 0.05、琼脂20;pH 7.2。

种子液培养基(g/L):蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 10;pH 7.0。

液体摇瓶发酵培养基 (g/L):柠檬酸13.5、谷氨酸10、NH4Cl 6.8、甘油 75、K2HPO41、MgSO4·7H2O 0.5、FeCl3·6H2O 0.02、CaCl20.2、MnSO4·H2O 0.05;pH 7.2。

斜面保存培养基 (g/L):蛋白胨10、酵母膏5、NaCl 10、琼脂20;pH 7.0。

以上培养基在121℃ 条件下高压蒸汽灭菌15～20 min。

1.1.3 主要试剂和仪器

培养基所用试剂(分析纯)，上海国药集团化学试剂有限公司;rTaq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、pMD19-T Vector，宝生物工程(大连)有限公司;细菌基因组DNA快速提取试剂盒，广州东盛生物科技有限公司;DNA凝胶回收试剂盒、PCR清洁试剂盒，爱思进生物技术(杭州)有限公司;PCR仪，美国Bio-Rad公司;CX21光学显微镜，日本奥斯巴林公司;NDJ-5S数字式黏度计，上海垒固仪器有限公司;冷冻干燥仪，美国Virtis公司;Biochrom 30全自动氨基酸分析仪，英国Biochrom公司;色谱工作站为美国Agilent 1200系统，配置Shodex 101示差折光检测器;SB-806M HQ型凝胶渗透色谱柱，Shodex公司。

1.2 菌株筛选

称取土样10 g，放入装有90 mL无菌水及玻璃珠的三角瓶内，室温下150 r/min振荡混匀30 min后，沸水浴 3 ～5 min，再依次制成 10－1、10－2、10－3、10－4、10－5和 10－6不同稀释度的土壤悬液，涂布于固体筛选培养基上，最后将平板置于37℃ 培养箱中培养1～2 d。从平板上挑选黏度较大，且能够拉丝的菌落，划线接种到固体筛选培养基上，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。纯培养菌种划线接种于斜面保存培养基上，4℃ 保存，每隔一个月转接活化1次。

1.3 液体发酵液的黏度测定

接种环挑取1环平板上单菌落接种到种子培养基中，30℃、170 r/min培养16 h，按5%接种量接种到液体摇瓶发酵培养基中(1/5装液量)，30℃、170 r/min摇床培养48 h后用NDJ-5S型数字式黏度计测定发酵液黏度。

1.4 γ-PGA的提取与纯化

发酵液10 000 r/min离心30 min后，取上清，加入4倍体积的预冷的无水乙醇，静置过夜，12 000 r/min离心，沉淀用去离子水溶解后，透析过夜，冷冻干燥得到固体初提物。初提物用去离子水溶解，12 000 r/min离心，上清加20 mg/mL蛋白酶K，去离子水透析过夜，再按上述方法离心，取上清冷冻干燥，得到γ-PGA固体纯化试样，-70℃ 保存。

1.5 γ-PGA的水解

取纯化的γ-PGA试样0.2 g放入水解管中，加入10 mL 6 mol/L的HCl，抽真空，维持10 min后封口，110℃ 水解24 h，冷却后过滤，再用旋转式蒸发仪浓缩，洗提3次，最后定容到10 mL，每一步均采用超纯水进行处理，取最终定容的滤液分析游离谷氨酸含量。

1.6 γ-PGA水解产物的分析

采用Biochrom 30全自动氨基酸分析仪对水解产物进行分析，上样量为20 μL。

1.7 γ-PGA相对分子质量测定

1)相对分子质量标准曲线的绘制 利用凝胶渗透色谱法(GPC)对γ-PGA相对分子质量进行测定。色谱条件:流动相0.2 mol/L Na2SO4，乙酸调节pH至4.0;流速1.0 mL/min;柱温35℃;紫外检测波长210 nm;进样体积20 μL。采用Shodex公司的葡聚糖标准品，根据出峰时间绘制标准曲线并拟合出相对分子质量计算方程:Y=－19 010+173 200 000 000Exp(－0.831 5X)，其中X为试样在紫外检测器上的保留时间，Y为试样的相对分子质量。γ-PGA相对分子质量标准曲线见图1。

图1 Shodex葡聚糖标准品相对分子质量标准曲线Fig.1 Standard curve of molecular weight of Shodex standard

2)相对分子质量测定 取一定量发酵液适当稀释，经0.22 μm微孔滤膜过滤去除菌体，备用。色谱条件同上。

1.8 生理生化鉴定

菌体形态特征和生理生化特征测定参照文献［11］进行。

1.9 菌株16S rDNA鉴定

1)16S rDNA基因序列的PCR反应 使用东盛公司的细菌基因组DNA快速提取试剂盒提取菌株C1的基因组DNA后，用细菌16S rDNA基因通用引物27F/1541R(正向引物27F:5'-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';反向引物1541R':5'-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3')进行PCR扩增。PCR反应条件:94℃ 预变性5 min，94℃ 变性45 s，55℃ 退火45 s，72℃ 延伸90 s，32个循环，再72℃ 延伸10 min。扩增完毕用8 g/L琼脂糖凝胶电泳检测产物大小。使用爱思进公司的DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物进行清洁回收。

2)16S rDNA基因序列测序 上述提取的含16S rDNA基因的重组质粒经酶切分析后，挑选具有正确大小插入片段的质粒进行测序，测序委托南京金斯瑞生物科技有限公司测定。

3)系统发育树的构建 将目的菌株16S rDNA测序结果在NCBI上进行BLAST，并与GenBank数据库做相似性分析，利用MEGA 4.0软件采用邻接法(Neighbor-Joining法)构建系统发育树图。

1.10 菌株合成γ-PGA功能基因的PCR扩增

根据文献［12］合成γ-PGA的功能基因团pgsBCA序列，设计3对合成γ-PGA的基因引物，见表1。

表1 基因pgsA、pgsB和pgsC的扩增引物Table 1 Primers for amplification of gene pgsA，pgsB，and pgsC

PCR反应体系除所用引物不同外，其他与16S rDNA基因序列的PCR反应相同。PCR产物用8 g/L琼脂糖凝胶电泳检测产物大小。

2 结果与讨论

2.1 γ-PGA产生菌的筛选

γ-PGA是一种生物源的高分子聚合物，其表观典型特征就是其黏度较大。因此，进行大量的初筛菌株时，通常普遍选用的方法是对其菌落和发酵液的表观现象进行检测。例如，惠明等［6］采用该方法筛选出了8株表观黏度较大的菌种，并最终通过复筛获得了1株γ-PGA高产菌株B.subtilis B53。笔者利用选择性培养基从土壤试样中分离培养出菌落较黏稠且能拉丝的菌株共39株。通过液体发酵培养基复筛，选取发酵液黏度较大的菌株7株，将这7株细菌经多次划线纯化及镜检后，斜面保存。

对保存的7株细菌进行摇瓶发酵试验，并测定其发酵液黏度值，结果见表2。由表2可知:菌株C1的黏度值为154.3 mPa·s，在所有筛选出的菌种中最大。因此，选择C1作为进一步研究的对象。

表2 菌株C1摇瓶产物的黏度值Table 2 Viscosity value of the fermentation flask culture of strain C1

2.2 菌株C1摇瓶发酵γ-PGA的产量测定

从C1菌株摇瓶发酵液提取纯化得到白色絮状的γ-PGA纯品，按1.5方法将其水解并进行氨基酸分析，结果见图2。由图2可知:经纯化后的水解产物基本上全为游离谷氨酸(18.4 g/L)，占总氨基酸的96%，其他氨基酸含量可以忽略不计，即C1菌株在液体摇瓶培养基中的产量可达到18.4 g/L。且经过几次传代培养后证明，其产量稳定。合成γ-PGA的细菌根据培养基中是否需要添加外源谷氨酸可分为两组，即非谷氨酸依赖性和谷氨酸依赖性，前者培养基中不需要添加外源谷氨酸，而后者合成γ-PGA严格依赖于培养基中添加的外源谷氨酸。B.subtilis var. polyglutamicun［13］、 B.licheniformis A35［14］和 B.licheniformis S173［15］均为非谷氨酸依赖性的菌株。然而，γ-PGA产生菌仍以谷氨酸依赖性居多，如:B.subtilis IFO 3335［16］、B.licheniformis ATCC 9945A［17］、B.subtilis MR-141［18］、B.subtilis subsp.chungkookjang［9］和 B.subtilis F-2-01［19］。由上述结果可知，筛选的菌株C1为1株谷氨酸依赖性菌株。

图2 菌株C1生产的γ-PGA水解液氨基酸分析图谱Fig.2 Amino acids analysis of hydrolysate of γ-PGA produced by C1

不同的菌株合成γ-PGA的能力不同，这不仅和菌株本身的遗传特性有关，也与培养基的营养成分有关。Goto等［13］发现 B.subtilis IFO3335在含有柠檬酸和谷氨酸的培养基中γ-PGA的产量可达到9.6 g/L。 Ashiuchi 等［9］发 现 B.subtilis subsp.chungkookjang在含有20 g/L谷氨酸的培养基中培养5 d，γ-PGA的产量可达到13.5 mg/mL。惠明等［20］发现柠檬酸、甘油和(NH4)2SO4是 Bacillus sp.B53合成γ-PGA比较适宜的C源和N源，前体物质L-谷氨酸的存在是聚谷氨酸高产所必需的;Bacillus sp.B53在优化培养基上产生γ-PGA 19.12 g/L，比原始基础发酵培养基上的8.87 g/L提高了115.56%。徐虹等［21］从土壤中筛选出 1株高产γ-PGA的菌株B.subtilis NX2，其合成γ-PGA的产量可高达41 g/L，但是这种高产量是通过添加70 g/L γ-PGA的前体物质谷氨酸实现的，发酵成本较高，但适宜大规模工业化发酵生产需求。筛选的菌株C1在含有10 g/L的谷氨酸的培养基中，通过摇瓶发酵γ-PGA的产量可达到18.4 g/L，成本低且底物转化率较高，因此具有一定的开发利用潜力，但后续研究还需确定菌株C1能否适应高浓度底物的发酵条件且仍具有较高的底物转化效率。

2.3 γ-PGA相对分子质量的测定

利用凝胶渗透色谱法(GPC)检测菌株C1发酵生产的γ-PGA的相对分子质量大小，γ-PGA的出峰时间为13.787 min(图3)。通过相对分子质量计算方程计算菌株C1生产的γ-PGA的相对分子质量为1.8×106。γ-PGA相对分子质量分布较广，通常在1.0×104～1.0范围内［22］。不同的菌株合成的γ-PGA相对分子质量不同，相同的菌株在不同的培养基中甚至在不同的生长阶段相对分子质量也不同。通常相对分子质量大于4.0×105的γ-PGA就可应用于化妆品领域，其吸水保湿性能较好［23］，菌株C1合成的γ-PGA相对分子质量为1.8×106，聚合度高，应用前景较好。γ-PGA具有多种应用的潜力［1］，有报道称，决定γ-PGA实际应用能力的一个关键特点是其相对分子质量大小［24］。然而，到目前为止，γ-PGA的功能和其结构特点(相对分子质量、D/L-谷氨酸比例等)的关系及作用机制还没有被报道［25］。因此，有关此方向的研究仍需要更深层次的开展以更大程度地对γ-PGA的应用进行开发。

图3 菌株C1发酵生产的γ-PGA的GPC检测图谱Fig.3 Molecular weight of γ-PGA produced by C1 detected by GPC

2.4 菌株C1的鉴定

2.4.1 菌株C1的形态鉴定

图4为菌株C1的显微镜及平板拉丝照片。由图4可知:菌株C1在固体筛选培养基上菌落为圆形，生长中前期，菌落表面光滑发亮，边缘整齐，中间突起，无色或略带黄色，半透明到透明，且黏度较大;生长后期，菌落表面变得不再光滑，且没有亮度也不再透明，菌落边缘开始出现褶皱，菌落不再突起。经镜检发现菌株C1为革兰氏阳性，细胞形状为杆状，产芽胞，且形成荚膜。

2.4.2 生理生化结果

参照《常见细菌系统鉴定手册》［11］，对菌株C1的部分生理生化实验进行了研究，结果见表3。

图4 菌株C1的显微镜及平板拉丝效果Fig.4 Morphology of strain C1 on the plate and under the microscope

表3 菌株C1生理生化实验结果Table 3 Results of physiological and biochemistry experiments of C1

由表3可知菌株C1具有以下特性:葡萄糖产酸产气，能利用淀粉、蔗糖、果糖、甘露醇和木糖，好氧，H2O2阳性，石蕊牛奶还原阳性，硝酸盐还原阳性，明胶液化，分解酪素，不分解酪氨酸等。与芽胞杆菌的生理生化描述一致。结合菌株C1的平板上形态特征及显微镜下形态特征确定菌株C1为芽胞杆菌。

2.5 16S rDNA鉴定

提取菌株C1的基因组DNA，经PCR扩增后回收测序，所测菌株C1的16S rDNA核苷酸序列长度为1 419 bp，序列送GenBank做BLAST分析。根据GenBank提供的基因序列，依据16S rDNA序列利用MEGA软件构建进化树进行分析(图5)。由图5可知:与菌株 C1同源性最高菌株的是 Bacillus amyloliquefaciens ATCC 23350，同源性为100%。因此，将菌株C1命名为Bacillus amyloliquefaciens C1，并将其16S rDNA基因序列上传到NCBI的GenBank数据库，登录号为JQ965939。

图5 菌株C1基于16S rDNA序列构建的系统发育树Fig.5 Phylogenetic tree based on partial 16S rDNA sequences of C1 and reference strains

2.6 菌株合成γ-PGA功能基因的PCR扩增

根据文献报道，设计 γ-PGA合成基因 pgsA、pgsB和pgsC的引物并对菌株C1的基因组进行PCR扩增，可以获得同文献报道片段大小一致的PCR条带，结果见图6。由图6可知:通过测序验证，pgsA、pgsB和pgsC的片段大小分别为 1 143、1 182和450 bp。从自然界中筛选的野生菌株合成γ-PGA的能力有限，往往不能满足工业发酵生产的需要，因此，有时需要对筛选的野生菌株发酵条件进行优化或者对其进行改造。Yooh等［26］利用分批补料发酵试验使得地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)合成γ-PGA的能力达到35 g/L。徐艳萍等［27］对地衣芽胞杆菌进行亚硝基胍和60Co诱变，获得1株γ-PGA的高产菌株C9，γ-PGA质量浓度由9.44 g/L提高到19.76 g/L，提高了109%。随着分子生物学技术在工业发酵微生物改造方面的应用，基因工程修饰将会更直接高效地提高目标菌株γ-PGA的发酵产量，本实验室将继续进行该方面的研究。

图6 pgsA、pgsB和pgsC基因PCR产物的琼脂糖电泳图谱Fig.6 Electrophoresis images of PCR products of pgsA，pgsB，and pgsC on agrose

3 结论

从土壤中筛选分离到1株产γ-PGA的细菌C1，在30℃、170 r/min条件下液体摇瓶发酵48 h，γ-PGA产量为18.4 g/L，相对分子质量为1.8×106。菌株C1菌落黏稠，为革兰氏阳性，产芽胞，能利用葡萄糖、蔗糖发酵，水解淀粉，H2O2酶阳性，产吲哚等，经16S rDNA鉴定为1株解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，并拥有γ-PGA合成的相关功能基因pgsA、pgsB和pgsC。综上所述，分离筛选的菌株C1生产γ-PGA产量高、相对分子质量大，且遗传特性稳定，具有较为广阔的开发应用前景。在后期工作中，还需确定菌株C1能否适应高浓度底物的发酵条件且仍具有较高的底物转化效率，并对该菌株进行基因工程改造，以提高γ-PGA的发酵产量。

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