IPAF和NALP1在RA滑膜中表达及其意义的探讨

梁 晶 潘云峰* 宋泽蓉 郭 欣 郭兴华

（广州市花都区人民医院风湿科，广东 广州 510800）

IPAF和NALP1在RA滑膜中表达及其意义的探讨

梁 晶 潘云峰* 宋泽蓉 郭 欣 郭兴华

（广州市花都区人民医院风湿科，广东 广州 510800）

目的 通过检测并比较类风湿关节炎、骨关节炎及关节创伤者组滑膜中IPAF1的表达，探讨IPAF和NALP1在类风湿关节炎滑膜中的意义。方法 免疫组化检测滑膜衬里层IPAF 和NALP1蛋白质表达，于显微镜下观察，随机选取4个视野，连续计数100个位于滑膜衬里层的细胞及其中的阳性细胞数，取平均值，计算阳性细胞率，间接比较蛋白表达。结果 滑膜组织免疫组化结果显示：RA组IPAF蛋白表达阳性率大于OA和Trauma组，差异均有统计学意义（P＜0.05）；NALP1仅在RA组表达，OA和Trauma组未见表达。结论 IPAF和NALP1在RA滑膜组织中有丰富表达，且其表达水平明显高于OA及Trauma组，提示IPAF和NALP1可能参与RA的慢性滑膜炎症过程。

类风湿关节炎；滑膜；IPAF；NALP1

类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种侵犯全身多关节的系统性疾病，主要以关节滑膜受累，滑膜炎性细胞浸润及衬里层增生是其典型病理改变。RA滑膜中的成纤维细胞样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte，FLS）发生了肿瘤样变，表现出逃脱免疫抑制，侵袭性，分泌细胞因子的特性，这些细胞因子是否在RA-FLS生物学特性改变中起作用及如何起作用尚不明确。众所周知，IL-1β在RA病情进展及局部炎症中发挥着重要作用，表现为：IL-1β是重要的软骨破坏因子，并抑制胶原蛋白合成，阻止关节破坏的修复；放大激活T细胞和B细胞，调节免疫反应，促进破骨溶骨等。而IPAF[the IL1B-converting enzyme （ICE）-protease activating factor]和NALP [NOD and the NTPases implicated in apoptosis and multihistocompatability complex transcription （NACHT）leucine-rich repeat protein]1是炎性复合体（inflammasome）的重要组份，它们与inflammasome的其他组份共同作用，加工某些炎性因子前体，使之成为有活性的炎性因子如IL-1β，从而参与多种自身免疫病的炎性反应。可见炎性复合体是IL-1β合成所必不可少的一种物质。由于RA、IL-1β及炎性复合体三者间的关系，我们有理由相信，IPAF和NALP1对RA炎症有一定贡献。本实验拟研究RA滑膜是否表达IPAF和NALP1及该表达对RA炎症有何意义。

1 材料与方法

1.1 材料

浓缩型DAB试剂盒（广州中杉金桥公司）；兔抗人IPAF多克隆抗体（美国Novus Biologicals公司）；小鼠抗人NALP1多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；羊抗兔IgG、兔抗鼠IgG（southern biotech公司）；PBS粉（欧蒙（杭州）医学实验诊断有限公司）；EDTA、免疫组化笔（广州中杉金桥）；二甲苯，无水乙醇，95%乙醇，75%乙醇，30%过氧化氢，Triton×100，苏木素，中性树胶。

1.2 实验方法

免疫组化染色法：常规脱蜡、水化后，高压修复抗原，依次一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育1 h，DAB显色，苏木素复染，脱水并透明，最后封片镜检。用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照，已知阳性的扁桃体切片作为阳性对照，实验步骤按试剂盒说明进行。

1.2.1 研究对象：滑膜组织来源为2008年4月至2011年5月中山大学附属第三医院行关节手术的膝关节。关节创伤（Trauma）患者3例，其中男∶女=3∶0，年龄39～46岁，病程5个月～3年。骨关节炎（Osteoarthritis，OA）患者4例，男∶女=1∶3，年龄45～73岁，病程3～13年。RA患者6例，男∶女=0∶6，年龄45～59岁，病程5～9年。所有RA患者诊断符合1987 年美国风湿病学会（american college of rheumatology，ACR）类风湿关节炎分类标准。所有OA患者诊断符合1986年美国风湿病学会（american college of rheumatology，ACR）骨关节炎分类标准。正常对照组取自关节创伤患者，符合：术中仅见创伤性关节炎性改变或无改变，排除RA、OA及其他关节病变诊断。免疫组化阳性对照标本为扁桃体炎患者行扁桃体摘除术所得的扁桃体组织。

1.2.2 标本采集和保存：标本离体后经10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，连续切片3张，分别行常规HE染色、免疫组化分析。

1.2.3 结果判断：根据HE染色片的结果区分标本的滑膜衬里层和滑膜下层。以细胞胞质出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。于显微镜200×视野下观察，随机选取4个视野，连续计数100个位于滑膜衬里层的细胞及其中的阳性细胞数，取平均值，计算阳性细胞百分率。

图1 免疫组化检测IPAF在滑膜组织中的表达（左100×，右200×）：（A 阳性切片（扁桃体组织）；B 阴性切片；C RA；D OA；E Trauma）

图2 免疫组化检测NALP1在滑膜组织中的表达（左100×，右200×）（A 阳性切片（扁桃体组织）；B 阴性切片；C RA；D OA；E Trauma）

1.2.4 统计学方法：应用SPSS 13.0软件进行统计分析，多组间用多组定量资料的方差分析和比较，两两之间的比较用LSD检验，检验水准α＝0.05。

2 结 果

阳性对照可见扁桃体生发中心呈明显胞质阳性，如图1、2中箭头所示。阴性对照全片未见任何棕黄或棕褐色颗粒。IPAF和NALP1具体阳性率详见表1和表2。

表1 三组标本滑膜衬里层IPAF免疫组化阳性细胞率（RA组n=6，OA组＝4，Trauma组＝3）

表2 三组标本滑膜衬里层NALP1免疫组化阳性细胞率（RA组n=6，OA组＝4，Trauma组＝3）

2.1 IPAF在滑膜组织中的表达

镜下观察可见IPAF在RA组滑膜衬里层的阳性细胞率比例高于OA组、Trauma组，见图1。对IPAF的三组行多组定量资料的方差分析和比较，结果显示三组间差别有统计学意义（F=6.870，P＜0.05）。用LSD法进行两两比较，结果显示RA与OA、RA与Trauma组间差异有统计学意义（P＜0.05），OA与Trauma间差别无统计学意义（P＞ 0.05）。

2.2 NALP1在滑膜组织中的表达

NALP1仅在RA组有表达，另两组为阴性，见图2。由于NALP1在OA和Trauma组均表达为阴性，故这三组不进行统计学分析。

3 讨 论

RA关节滑膜炎是其基本病理特征，其中以滑膜衬里层增生为著。RA滑膜衬里层由正常的2～3层增厚至10～20层，主要为巨噬细胞样滑膜细胞（macrophage-like synoviocytes，MLS）和成纤维细胞样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte，FLS）[1]。MLS表现出高度活性，可产生大量前炎性因子、趋化因子、生长因子，如肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor –alpha，TNF）-α、TGF-β、IL-1和IL-6[2-4]。这些因子能够激活滑膜衬里层的FLS，并诱导其产生一系列介质，使FLS具有独特的侵袭特性及其能够合成多种蛋白酶，直接和间接的侵蚀软骨及骨组织，使之成为软骨破坏的最主要因素[5]。

IL-1β转化酶蛋白酶激活因子[the IL1B-converting enzyme（ICE）-protease activating factor （IPAF）]和NOD和与细胞凋亡和组织相容复合体转录（NACHT）相关的富集亮氨酸的NTP蛋白酶[NOD and the NTPases implicated in apoptosis and multihistocompatability complex transcription （NACHT）leucine-rich repeat protein，NALP]1均是NLRs[nucleotide-binding and oligomerisation domain （NOD）-like receptors]家族成员。临床和实验研究表明，二者分别作为炎性复合体（inflammasome）-IPAF inflammasome 和NALP1 inflammasome的重要组份，经一系列反应，最终促进炎性因子如IL-1β合成，因此，二者在自身反应性炎症和某些炎性风湿病的发病中起到重要作用，如幼年特发性关节炎全身发作（systemic onset juvenile idiopathic arthritis,SOJIA）[6]，成人Still病[7,8]，痛风[9-11]和类风湿关节炎[12]，但它们在疾病中哪些组织细胞表达、具体作用机制如何，目前尚不明确。

研究认为，巨噬细胞和角质化细胞分泌IL-1β有赖于炎性复合体的参与。NALP1和IPAF是炎性复合体的重要组分，在正常细胞内环境下，这两种蛋白质功能受到抑制，处于失活状态。NALP1和IPAF的NACHT结构域被LRR域折叠，防止激活。当内环境接受PAMP或感受到危险信号时，LRR域诱导构象重排，暴露NACHT结构域并发生寡聚化，招募下游的inflammasome蛋白。随后经ASC介导，caspase激活。最终，活化的caspase使IL-1β等炎性因子前体成熟，参与炎性反应。

RA-FLS在病情进展中发生了类肿瘤样变化，表现出一些不同于正常FLS的特性，如免疫逃逸，接触抑制能力消失，自分泌炎性因子。多种炎性因子的合成有赖于IPAF和NALP1的作用，因此，我们推测，RA-FLS可能表达IPAF和NALP1，它们可能在RA-FLS分泌炎性细胞因子过程中发挥重要作用。在本课题中，我们首先对标本行HE染色以鉴定滑膜组织，并对滑膜衬里层进行定位，随后应用免疫组化法检测RA、OA及Trauma三组滑膜组织中滑膜衬里层IPAF和NALP1的表达情况，发现IPAF高度表达于RA滑膜衬里层，且水平明显高于OA组和Trauma组，经分析，差别有统计学意义。NALP1在RA滑膜衬里层有表达，但在OA、Trauma组中未见表达。因此，鉴于IPAF及NALP1在炎症中的特殊地位及我们的实验结果，我们有理由相信这二者与RA炎症有着密切的关系。该作用发生于何种细胞、经过何种途径、有无其他调节方式，有待后续研究。考虑到滑膜衬里层主要由MLS和FLS二种细胞组成，免疫组化仅能说明滑膜炎症与IPAF及NALP1有关，不能区分主要通过哪种细胞作用，下一步实验将着重研究RA炎症中占主要作用的FLS与IPAF及NALP1间的关系。目前已有部分研究成果，我们发现，在体外培养的RA-FLS中，IPAF和NALP1的表达水平均高于Trauma组[13]，这进一步验证了我们的观点，即IPAF和NALP1可能参与RA的慢性滑膜炎症过程。

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The Expression and Significance of NALP1 and IPAF of Synovial Obtained from Rheumatoid Arthritis

LIANG Jing, PAN Yun-feng*, SONG Ze-rong, GUO Xin, GUO Xing-hua
(Department of Rheumatology and Immunology, Huadu District People's Hospital, Guangzhou 510800, China)

Objective To investigate the significance of NALP1 and IPAF of synovial obtained from rheumatoid arthritis. Methods Test the NALP1 and IPAF protein expression by immunohistochemical in synovial. Choose 4 perspectives randomly, counter 100 cells in synovial intimal lining and the positive ones continuously, then the positive cell percentage has been calculated from their percentage. Results The expression of IPAF in synovial lining cells of RA samples was significantly higher than that of OA or Trauma(P＜0.05). NALP1 was expressed in RA samples only, while no expression in OA and Trauma samples(P＜0.05). Conclusion RA synovial tissue highly expresses IPAF and NALP1, and the expression of IPAF was significantly higher than that in OA and control，suggesting that IPAF and NALP1 maybe involved in RA chronic synovial inflammation process.

Rheumatoid arthritis; Synovial; IPAF; NALP1

R593.22

B

1671-8194（2014）19-0001-03

广东省科技厅社会发展领域科技计划项目课题（项目编号：1111510400180）

*通讯作者：Email：p-yunfeng@163.com