药品微生物限度检查用培养基储存期限的探讨

陈晓燕

（浙江省玉环县食品药品检验检测中心，浙江 玉环 317605）

药品微生物限度检查用培养基储存期限的探讨

陈晓燕

（浙江省玉环县食品药品检验检测中心，浙江 玉环 317605）

目的 对药品微生物限度检查用培养基的储存期限问题进行研究，通过实验确定最优存储方法和时限。方法 分别将现配培养基为对照与2～8 ℃避光冷藏15、30、60 d的培养基进行微生物限度适用性检查，用标准菌株在各培养基中生长情况通过回收率及指示能力确定在此环境中保存配制好经灭菌的培养基的适用性符合药典相关规定。结果 各标准菌株大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌于各培养基在促生长能力检查时的回收率均＞70%，及各培养基对相应试验菌的指示能力均符合规定。结论 配制好经灭菌的培养基在2～8 ℃避光冷藏60 d可以达到要求。

药品微生物限度检查；培养基；保存；回收率

2010版《药典》附录ⅩⅢ C微生物限度检查法未对适用培养基的储存条件及期限进行规定。为保证实验质量，本文通过实验研究对配制好用硅胶塞及牛皮纸捆绑包裹瓶口经灭菌的培养基在温度为2～8 ℃避光储藏，分别于15、30、60 d进行适用性检查，已确保微生物限度检查结果的可靠。

1 材料设备

1.1 仪器设备：恒温干燥箱；净化工作台；生化培养箱；立式压力蒸汽灭菌器；霉菌培养箱。

1.2 菌种：大肠埃希菌［CMCC（B）44102］；金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］；枯草芽孢杆菌［CMCC（B）63501］；白色念珠菌［CMCC（F）98001］；乙型副伤寒沙门菌［CMCC（B）50094］；黑曲霉菌［CMCC（F）98003］。以上均从广东省微生物研究所菌种保藏中心购得的冷冻干燥菌种，按规定复苏、传代、保藏和使用，试验用菌株的传代次数均未超过5代。

1.3 培养基：营养琼脂培养基；玫瑰红钠琼脂培养基；甘露醇氯化钠琼脂培养基；溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基；麦康凯培养基。以上培养基均由环凯生物制品有限公司购进，均在有效期内按成品培养基说明配置使用。

2 方法和结果

2.1 实验环境

在环境洁净度10000级下的局部洁净度100级的单向流空气超净台中操作。

2.2 菌液制备

2.2.1 接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中，33 ℃培养24 h，用0.9%的无菌氯化钠溶液，10倍递增稀释成每1 mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液，室温放置下2 h内使用。

2.2.2 接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，27 ℃培养48 h，用0.9%的无菌氯化钠溶液，10倍递增稀释成每1 mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液，室温放置下2 h内使用。

2.2.3 接种黑曲霉菌新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，27 ℃培养7 d，加入5 mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然后用开口带有薄的无菌棉花能过滤菌丝的无菌毛细吸管，吸出孢子悬液质无菌试管内，用0.9%的无菌氯化钠溶液，10倍递增稀释成每1 mL含菌数为50～100 cfu的菌悬液，2～8 ℃放置下，24 h内使用。

2.3 培养基配置

取各类培养基按要求用500 mL三角烧瓶各配制200 mL，用硅胶塞及牛皮纸捆绑包裹瓶口灭菌备用作为对照培养基。另取上述培养基按要求用500 mL三角烧瓶各配制200 mL，用硅胶塞及牛皮纸捆绑包裹瓶口后置于2～8 ℃避光冷藏15、30、60 d。

2.4 试验方法和结果

分别将现配对照培养基与2～8 ℃避光冷藏15、30、60 d的培养基进行适用性检查（促生长能力和抑制能力；指示能力），每个培养基进行3次独立的平行实验，所得菌落数为3次独立平行实验的平均数。

2.4.1 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌混悬液各2 mL分别放于6个平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，同时做空白对照，置30～35 ℃培养48 h，计数。结果见表1。

表1 营养琼脂培养基适用性检查

2.4.2 取白色念珠菌、黑曲霉菌的菌悬液-各2 mL分别放入4个平皿中每种菌悬液各2皿，每皿各1 mL），加入玫瑰红钠琼脂培养基各20 mL，混匀，同时做一空白试验。27 ℃培养72 h，计数。结果见表2。

表2 玫瑰红钠琼脂培养基适用性检查

2.4.3 取乙型副伤寒沙门菌的菌悬液各0.2 mL，分别涂布接种与2个已预培养8 h后并无菌生长的麦康凯琼脂培养基中，混匀。同时，做一空白试验。33 ℃培养18 h，计数（空白试验培养48 h观察结果）。结果见表3。

表3 麦康凯琼脂培养基适用性检查

2.4.4 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌的菌悬液各0.2 mL，分别涂布接种与已预培养8 h后并无菌生长的甘露醇氯化钠琼脂培养基各2皿中，混匀。同时，做一空白试验。33 ℃培养24 h，计数（空白试验和接种大肠埃希菌平皿的试验培养72 h观察结果）。结果见表4。

表4 甘露醇氯化钠琼脂培养基适用性检查

2.4.5 取大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的菌悬液各0.3 mL，分别涂布接种与已预培养8 h后并无菌生长的十六烷基三甲胺琼脂培养基各3皿中，混匀。同时，做一空白试验35 ℃培养18 h，计数（空白试验和接种大肠埃希菌平皿的试验培养72 h观察结果）。结果见表5。

表5 十六烷基三甲胺琼脂培养基适用性检查

2.4.6 指示能力试验：取试验菌0.1 mL，分别涂布于被检培养基和对照培养基上，在相应的控制菌检查规定的培养温度和时间下培养，结果被检培养基上试验菌的菌落形态，菌落颜色及指示反应情况与对照培养基一致。各试验菌在相应的培养基上的形态，颜色均与在对照培养基上抑制。

3 结 论

在《食品微生物学检验 培养基和试剂质量要求》通常建议实验室自制培养基在保证其成分不会改变条件下保存，即避光、干燥保存，必要时在（5±3） ℃冰箱中保存，瓶装及试管装培养基不超过3～6个月[5]。而《药典》附录XⅢ2010版对微生物限度检查的瓶装培养基未明确进行规定和建议。本文通过实验表明，接种大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌于各培养基在促生长能力检查时的回收率均＞70%，及各培养基对相应试验菌的指示能力均符合规定，空白对照无菌生长。可知，本实验室配制经灭菌后培养基的储存时限可采用在2～8 ℃冷藏保存期限为60 d，其结果符合药典相关规定。日常工作中保证了微生物限度检查结果的可靠、有效。

[1] 国家药典委员会中华人民共和国药典.附录XⅢ[M].北京:化学工业出版社,2010.

[2] 中国药品生物制品检定所中国药品检验标准操作规范[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

[3] 苏德模,马绪荣.药品微生物学检验技术[M].北京:华龄出版社, 2007.

[4] 药品GMP指南[M].北京:.中国医药科技出版社,2010.

[5] GB.4789.28-2013.食品安全国家标准、微生物学检验、培养基和试剂的质量要求[S].北京:中国标准出版社,2013.

R446.5

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1671-8194（2014）19-0111-02