GSH对MRL/1pr小鼠肾小管上皮细胞CTGF表达的影响研究

刘树锋 张北平 王 海 谭 校

（汕头大学医学院附属粤北人民医院风湿免疫科，广东 韶关 512026）

GSH对MRL/1pr小鼠肾小管上皮细胞CTGF表达的影响研究

刘树锋 张北平 王 海 谭 校

（汕头大学医学院附属粤北人民医院风湿免疫科，广东 韶关 512026）

目的 研究还原型谷胱甘肽（GSH）对MRL/lpr小鼠（狼疮小鼠）肾小管上皮细胞结缔组织生长因子（CTGF）的表达，明确抗氧化药GSH对肾小管上皮细胞表达CTGF的影响。方法 传代培养正常小鼠及狼疮小鼠肾小管上皮细胞至第3代，使用GSH干预生长MRL/lpr小鼠肾小管上皮细胞，培养5 d后检测CTGF蛋白及mRNA的表达。结果 狼疮小鼠肾小管上皮细胞内CTGF表达明显高于正常对照组（P＜0.01）。经GSH干预后MRL/lpr小鼠模型肾小管上皮细胞CTGFmRNA表达较未处理组显著降低（P＜0.01）。结论 狼疮小鼠肾小管上皮细胞内CTGF表达明显升高，抗氧化剂GSH干预可抑制狼疮小鼠肾小管上皮细胞CTGF表达。

还原性谷胱甘肽；肾小管上皮细胞；结缔组织生长因子

系统性红斑狼疮（SLE）是一种常见自身免疫性疾病，几乎所有患者都有肾脏病理损害，在狼疮性肾炎（LN）发病机制中，沉积的免疫复合物介导的炎性细胞释放出大量的超氧阴离子以及活性氧簇（ROS），并且能合成和释放转化生长因子-β（TGF-β）、CTGF等活性细胞因子，可造成肾脏的形态学和功能改变，促进肾间质成分纤维化增生。这一系列改变与肾组织抗氧化能力降低密切相关[1]。GSH是抗氧化防御系统中的最主要成分，在机体的抗氧化损伤中发挥重要作用[2]，SLE患者血清中GSH降低，加重LN中的氧化损害，而一定水平的GSH在LN的抗氧化保护中起到重要作用[3]。CTGF已经被证实与LN间质纤维化有明显相关性，LN中氧化损害可致CTGF表达增多，肾组织纤维化发展。本研究通过研究狼疮小鼠肾小管上皮细胞中CTGF的表达，并进一步研究抗氧化剂GSH对狼疮小鼠肾小管上皮细胞中CTGF的表达影响，探讨GSH抗氧化作用在LN间质纤维化中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象：正常对照组：SPF级C57BL/6雌性小鼠；LN模型组：SPF级MRL/1pr雌性小鼠，各6只。

1.2 试剂及仪器：Trizol Reagent（Invitrogen公司），PrimeScript RTPCR试剂盒（宝生物工程有限公司），2×EasyTaqPCRSuperMix试剂盒（全式金生物技术有限公司），PCR引物合成（瑞真生物技术有限公司），T Gradient PCR仪（Biometra公司），胎牛血清（GIBCO），CTGF酶联免疫吸附法试剂盒（瑞齐生物公司），还原型谷胱甘肽（重庆药友制药有限责任公司）。

1.3 取16周龄SPF级MRL/1pr雌性小鼠及C57BL/6 雌性小鼠各6只，断颈法处死。分别于无菌环境下分离肾小管节段，采用胰蛋白酶消化各于六孔板细胞培养板传代培养肾小管上皮细胞，稳定培养至第3代，分3个实验为组，每组6个样本处理如下：①正常对照组肾小管上皮细胞（NS 0.9%干预）②狼疮小鼠肾小管上皮细胞（NS 0.9%干预）③狼疮小鼠肾小管上皮细胞（GSH 0.5mg/ml干预组）。

1.4 细胞培养至第5天，用Trizol Reagent分别提取细胞总RNA，反转录成cDNA用荧光定量PCR方法检测CTGF的mRNA水平（各步骤均按照试剂盒说明操作）。3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）为内参照；上海英骏生物技术有限公司合成引物：GAPDH （150bp）上游：TGTGTCCGTCGTGGATCTGA，下游：TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG；CTGF（112bp）上游: GTGTGTGACGAGCCCAAGGA，下游: AGTTGGGTCTGGGCCAAATGT，反应条件95 ℃ 5min→94 ℃ 10s→59 ℃，45个循环。重复3次独立的RT-PCR全过程。以倍比稀释的cDNA为模板制作标准曲线，R2＞0.98。经细胞裂解液裂解细胞，酶联免疫吸附法检测CTGF蛋白浓度。

2 实验结果

2.1 统计学处理

用SPSS15.0统计软件进行统计分析，数据用均数±标准差（）表示，两样本比较用t检验。P＜0.01为差异有统计学意义。

2.2 CTGF的表达检测结果

见表1。

表1 CTGF的表达检测结果

3 结 论

狼疮小鼠肾小管上皮细胞内CTGF mRNA及蛋白表达均明显高于正常对照（P＜0.01），经GSH干预培养后，狼疮小鼠肾小管上皮细胞内CTGF mRNA及蛋白表达均降低（P＜0.01）。

4 讨 论

在对终末期肾病肾小管间质病变中，已经证实免疫性炎症联合氧化损害可以引起TGF-β1合成和分泌，刺激肾小管上皮细胞分泌CTGF，CTGF作用于间质细胞及肾小管上皮细胞，促使胶原合成和细胞外基质的堆积、成肌纤维细胞的形成，使肾间质纤维化发展。既往研究证实，在LN病理中，炎症损害导致活性氧分子大量产生，致使抗氧化防御稳态失衡；同时机体内最重要的抗氧化因子GSH水平下降[4]，导致肾小管上皮细胞CTGF合成增加，加速肾间质纤维化发展。本研究证实，在狼疮小鼠肾小管上皮细胞中，CTGF表达高于正常对照组，国内也有研究发现正常肾组织没有或只有极少量CTGFmRNA 转录和蛋白表达[5]，LN患者肾组织CTGF表达量显著增加，并与肾小管间质病变程度成正比[6]，进一步说明在狼疮小鼠肾小管上皮细胞中CTGF的高度表达，参与介导了肾间质纤维化改变。

既往研究证实，在狼疮患者脂质过氧化与肾脏和动脉病变存在统计学关联[7]，LN患者体内普遍存在氧化应激，与免疫性炎症一起参与肾病的发病与病程进展，机体内抗氧化功能相对或绝对的降低，出现氧化/抗氧化失平衡，导致肾组织氧化损害。GSH是抗氧化防御系统中的最主要成分，可以直接对抗活性氧自由基，减少氧自由基对肾组织的损伤作用。目前研究证实：在SLE患者体内GSH水平明显降低[8]。在本研究中，经过GSH干预培养的肾小管上皮细胞内CTGF表达明显降低，说明GSH可能通过改善细胞氧化应激状态降低CTGF的表达，从而对其介导的胶原增生有一定的阻断作用。这种阻断效应可用于改善狼疮性肾病的长期预后，减缓间质纤维化进程，保护残存肾单位功能。目前在多种肾病的临床治疗过程中已经使用GSH抗氧化损害，对于肾功能及预后有所改善[9-10]，进一步的研究需要监测经过GSH治疗的SLE患者肾组织CTGF以及纤维化程度，评估其对肾间质纤维化的治疗效果，可能为探索抗纤维化治疗提供的更多依据。

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R593.24+1

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1671-8194（2014）19-0113-02