HPLC法测定骨伤愈合胶囊中三七皂苷R1的含量

唐 何毛谊平林 海* 李子君任荣军

（1 湖南省食品药品检验研究院,湖南 长沙 410000；2 岳阳市食品药品检验所,湖南 岳阳 414000；3 湖南省中药不良成分快速检测及脱除工程技术研究中心,湖南 长沙 410208）

HPLC法测定骨伤愈合胶囊中三七皂苷R1的含量

唐 何1毛谊平2林 海1* 李子君2任荣军2

（1 湖南省食品药品检验研究院,湖南 长沙 410000；2 岳阳市食品药品检验所,湖南 岳阳 414000；3 湖南省中药不良成分快速检测及脱除工程技术研究中心,湖南 长沙 410208）

目的建立HPLC法测定骨伤愈合胶囊中三七皂苷R1含量。方法色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为203 nm，柱温为30 ℃。结果三七皂苷R1在0.2048～2.0480 μg范围内线性关系良好，r=0.9999（n=5），平均回收率为99.0%（n=9），RSD为0.8%。结论该方法灵敏、准确、专属性强，能简便有效控制骨伤愈合胶囊中三七皂苷R1的含量。

高效液相色谱；骨伤愈合胶囊；三七皂苷R1

骨伤愈合胶囊为湖南省汨罗市中医院医院制剂,处方是多位骨科专家十多年的临床经验方,由三七、当归、红花、大黄、乳香、没药六味中药组成,具有活血化瘀、消肿止痛的作用,用于跌打损伤,伤筋动骨,瘀血肿痛等症[1]。目前该药已治疗各种跌打损伤及骨折近5000余病例,效果显著,尚无一例不良反应,确实为治疗跌打损伤和骨折的理想药物。三七具有“止血,散血,定痛”的功效,为本方君药。而目前尚未见对骨伤愈合胶囊中三七成分进行定量控制的报道,为有效保证本产品质量,本试验选取三七中有效成分三七皂苷R1为指标成分,采用HPLC法对其进行含量测定,该方法简便,能有效控制骨伤愈合胶囊中三七皂苷R1的含量,现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器:Waters 2695/2489高效液相色谱仪；电子分析天平（梅特勒公司）；超声波清洗机（济宁奥波超声电气有限公司）。

1.2 试药:三七皂苷R1对照品（批号:110745-200617,供含量测定用,中国食品药品检定研究院）；骨伤愈合胶囊（批号为20121017、20121126、20121225,规格:0.4克/粒）；乙腈为色谱纯,水为纯净水,其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件:Agilent ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；流动相:乙腈（A）-0.4%磷酸溶液（B）梯度洗脱（0～12 min,81%～81% B；12～25 min,81%～70%B；25～28 min, 70%～81%B）,流速为1.0 mL/min,检测波长为203 nm,柱温为30 ℃；进样量10 μL。

2.2 溶液的制备

①对照品溶液制备:精密称取三七皂苷R1对照品适量,加甲醇制成每1 mL含0.1024 mg的溶液,即得。②供试品溶液制备:取装量差异项下本品内容物,研细,取约2.7 g,精密称定,置锥形瓶中,精密加入甲醇50 mL,80 ℃水浴回流15 min,放冷,再称定重量,用甲醇补失重量,摇匀,滤过,取续滤液,即得。③阴性样品溶液制备:按处方中药味比例,制备不含三七的阴性样品,按上述供试品溶液的制备方法制阴性样品溶液。

2.3 专属性试验

取供试品溶液、对照品溶液与阴性样品溶液各10 μL注入高效液相色谱仪,记录色谱图。结果表明供试品溶液与对照品溶液在约17 min处有相对应的色谱峰,阴性样品无干扰,理论塔板数以三七皂苷R1计＞4000,分离度＞1.5。见图1。

2.4 线性关系考察

分别精密吸取对照品溶液2、5、10、15、20 μL注入液相色谱仪测定。以对照品进样量（μg）为横坐标,峰面积为纵坐标,得回归方程为Y=5.77×106x＋868.12,R=0.9999。表明三七皂苷R1在0.2048～2.048 μg范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取同一供试品溶液（批号:20121017）10 μL,连续进样5次测定,其三七皂苷R1峰面积RSD为0.5%,表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液（批号:20121017）,分别于0、2、4、8、12、24 h,精密吸取10 μL,注入液相色谱仪,测定,结果峰面积RSD为1.0%,表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.7 重复性试验

图1 A对照品、B供试品、C阴性样品（三七皂苷R1）

取同一批号（20121017）样品6份,按2.2.2项下制备供试品溶液,进样测定,得三七皂苷R1平均含量为0.42毫克/粒,RSD为0.6%（n=6）,表明方法重复性良好。

2.8 回收率试验

精密称取已知含量的同一批号（20121017）骨伤愈合胶囊样品（0.42毫克/粒）约0.4 g,精密称定,分别精密加入三七皂苷R1对照品溶液4 mL,按2.2.2项下方法制备供试品溶液,测定,计算回收率。结果表明方法回收率良好,见表1。

表1 回收率试验表

2.9 样品测定

精密量取供试品溶液及三七皂苷R1对照品溶液（0.1024mg/mL）各10 μL,注入高效液相色谱仪,按外标法计算三七皂苷R1的含量。样品中三七皂苷R1含量测定结果为:批号20121017含量为0.42毫克/粒,批号20121126含量为0.44毫克/粒,批号20121225含量为0.40毫克/粒。

3 讨 论

3.1 检测波长的选择。取三七皂苷R1对照品甲醇溶液,在190～400 nm的波长范围内扫描,结果表明三七皂苷R1在波长195 nm左右处有最大吸收,考虑溶剂的影响,在参考文献[2-3]的基础上,选择203 nm作为含量测定的检测波长。

3.2 流动相的选择。本实验参考文献[4-6],考察了多种流动相,如:乙腈-水溶液、乙腈-0.3%磷酸溶液、乙腈-甲醇-水溶液,通过观察比较色谱峰峰形、理论塔板数及峰拖尾因子,认为乙腈-0.4%磷酸溶液梯度洗脱,系统峰形较好,理论塔板数高,分离度达到要求,故选择其为该色谱分析条件。

3.3 本制剂属纯中药复方制剂。本试验对处方中三七皂苷R1进行HPLC测定研究,该方法灵敏、准确、专属性强,能简便有效控制骨伤愈合胶囊中三七皂苷R1的含量,取得了较好的效果,从而进一步完善了骨伤愈合胶囊的质量控制标准。

[1] 向海洋.骨伤愈合胶囊定性定量研究[J].中南药学,2010,8(4):289-292.

[2] 谢耀轩,林亚珠.超高效液相色谱法测定三七中人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量[J].广东药学院学报,2011,27(5):489-492.

[3] 俞坚,刘杭,王京霞.高效液相色谱法测定三七片中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的含量[J].中华中医药学刊,2008,26(2):421-422.

[4] 杨雪梅,刘旭,刘艳山,等.高效液相色谱法测定三七中三七皂苷R1及人参皂苷Rg1,Rb1的含量[J].时珍国医国药,2005,16(8):710-711.

[5] 孙巍,任斯文.高效液相色谱法测定利节散中三七皂苷R1和人参皂苷Rg1的含量[J].中国中医药杂志,2008,6(12):1-4.

[6] 李性天,周密妹,耿立坚,等.高效液相色谱法梯度法测定三七中三七皂苷R1含量[J].中国医院药学杂志,2000,20(12):728-729.

Determination of Notoginsenoside R1 in Gushang Yuhe Capsules by HPLC

TANG He1, MAO Yi-ping2, LIN Hai1*, LI Zi-jun2, REN Rong-jun2
(1 Hunan Institute Food and Drug Control, Changsha 414000, China; 2 Yueyang Institute Food and Drug Control, Yueyang 414000, China; 3 Hunan Research Center of Engineering Technology for Rapid Test and Removal of Toxic and Harmful Substances in Chinese Medicine, Changsha 410208, China)

ObjectiveTo establish an HPLC method for determination the content of Notoginsenoside R1 in Gushang Yuhe Capsules. Methods The column was Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)and the temperature was 30 ℃;The mobile phase was acetonitrile-0.4% phosphoric acid solution with linear gradient elution, detection was done at 203nm and a flow rate of 1.0 mL/min.ResultsNotoginsenoside R1 has a good linear relationships in 0.2048～2.048 μg(r=0.9999);the average recovery was 98.97%(n=9,RSD was 0.8%.ConclusionThe methods are sensitive, accurate and specific,which can be used for the quality control of Gushang Yuhe Capsules.

HPLC; Gushang Yuhe Capsules; Notoginsenoside R1

R282

B

1671-8194（2014）25-0006-02

2013年湖南省科技计划项目（编号：2013SK5072）