T1脂肪酶催化合成甘油酯过程酯化率变化规律研究

钟金锋 覃小丽， 王永华

（西南大学食品科学学院1，重庆 400715）

（华南理工大学轻工与食品学院2，广州 510640）

甘油酯是一系列食品、药物、化妆品中常用的功能性添加剂[1-2]，因此，高效地制备高品质的甘油酯是油脂工业的研究热点之一。与传统化学合成法存在反应温度高、设备腐蚀严重、产品难以分离等特点相比，酶法催化合成甘油酯过程反应条件温和、产物选择性强，设备要求低而颇受研究者的关注[3-5]。

目前，国内外研究酶法催化合成甘油酯研究中主要采用商业化脂肪酶如Novozym 435、Lipozyme TL IM和Lipozyme RM IM，其成本较高，所以不断发现和研究新型脂肪酶，探索新型脂肪酶分离纯化、固定化、催化作用机理及其潜在应用成为酶工程研究重点之一。T1脂肪酶从Geobacillus zalihae strain T1分离得到，是一种新型脂肪酶，其在较高的反应温度（60℃）下保持较高的酶活性[6]，因此，T1脂肪酶在油脂改性工业具有较好的应用前景。目前，国内外关于T1脂肪酶的研究主要集中在T1脂肪酶的高效表达、分离纯化[7]、酶学性质[6]及分子催化机理方面的研究[8]，而对于T1脂肪酶的应用研究，尤其是在油脂改性方面的报道较少。本课题组前期工作中采用T1脂肪酶催化高熔点油脂（棕榈硬脂）的水解反应制备甘油二酯，结果显示水解产物中甘油二酯含量相对较低（28%）[9]。

为了进一步研究T1脂肪酶在油脂改性方面的潜在应用，提高T1脂肪酶催化反应速率，增加目标产物甘油酯的含量，本研究以油酸和甘油为反应底物，以自制T1脂肪酶为催化剂，通过直接酯化反应的方式制备甘油酯，考察不同反应条件对油酸酯化率的影响及油酸酯化反应转化为甘油酯的动力学方程，通过规划拟合求解确定方程各阶段的反应系数，分别探讨各反应条件与对应动力学方程系数的关系，以期获得T1脂肪酶通过酯化法催化合成甘油酯的动态反应历程的变化规律，为研究各个目标产物（如甘油一酯和甘油二酯）的变化规律奠定基础，为将来T1脂肪酶应用于甘油酯合成的工业化进行最优化设计及最佳控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大肠杆菌 pET-23a-CBD-T1-BL21由本课题组提供[9]；油酸（＞76%，分析纯）：上海晶纯试剂有限公司；胰蛋白胨和酵母提取物：OXOID公司；三油酸甘油酯，甘油二酯（由15%的1，2-二油酸甘油二酯和85%的1，3-二油酸甘油二酯组成）、单油酸甘油酯标准品：Sigma-Aldrich公司。

1.2 方法

1.2.1 T1脂肪酶制备及酶活测定[9]

制备步骤：将含有重组质粒的pET-23a-CBD-T1-BL21菌种按2%接种量接种于LB培养基（蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠0.5%，W／V）中，加入氨苄青霉素使其终浓度为100μg／mL，置于在37℃摇床（200 r／min）培养。当培养至 OD600＝0.6～0.8，加入诱导剂 IPTG使其终浓度为 0.05 mmol／L，然后将其置于20℃继续培养12 h后离心（4℃，12 857×g，20 min）收集菌体。用 PBS缓冲溶液（137 mmol／L NaCl，2.7 mmol／L KCl，10 mmol／L Na2HPO4，2 mmol／L KH2PO4，pH 7.4）重悬菌体，然后将重悬液置于冰水浴中进行细胞破碎（超声波破碎仪的功率250W，脉冲3 s，间隔3 s，15 min）。对离心（4℃，12 857×g，20 min）后细胞裂解液上清液进行真空冷冻干燥，冻干后得到的酶粉为T1脂肪酶粗酶。

测定方法：将甘油（29.34 mmol）和油酸按物质的量比2∶1混合添加到25 mL带塞三角瓶并充分混合，加入适量的粗酶（精称0.13 g）和7%（占底物质量）的 Tris-HCl缓冲液（50 mmol／L，pH 9.0），置于温度为60℃的恒温磁力搅拌器（542 r／min）中反应20 min。反应初始和20min时取样离心（6 950×g，10 min），精确称取0.1 g油相（上层）并充分溶于异丙醇（25 mL）中，以1%酚酞为指示剂，以KOH标准溶液（0.1mol／L）滴至红色时为滴定终点（30 s不褪色），记录KOH消耗量。每个样平行测定2～3次，测定结果取其平行测定的算术平均值。

1.2.2 酶促酯化反应

反应在25 mL具塞锥形瓶中进行。将甘油和油酸按一定物质的量比添加到锥形瓶中，分别加入粗酶（9.7 U／g，占总底物质量）和一定量的Tris-HCl缓冲液，在一定温度的水浴搅拌器（542 r／min）中反应，在 0、3、6、9和 12 h时取样，离心（6 950×g，10 min）后取油相进行色谱分析酯化产物组成。同一条件进行2次平行试验，以2次测定结果的算术平均值为最终测定结果。

1.2.3 酯化产物组成分析

样品处理：取20μL油相（上层）酯化产物于1.5 mL进样品中，用1 mL流动相充分溶解。采用高效液相色谱法—示差检测器（HPLC-RID）对酯化产物组成进行分析。其分析条件为：Waters 1525型HPLC；检测器，2414示差检测器；色谱柱，Luna 5u Silica（2）100A，250 mm ×4.60 mm i.d.（phenomenex）；柱温，35℃；流动相，正己烷／异丙醇／甲酸（15∶1∶0.003，体积比），流速 1.0 mL／min；进样量，10 μL。采用面积归一化法定量，得到反应混合物中油酸的相对含量，根据式（1）计算油酸的酯化率：

式中：F0为应初始（t＝0）时底物中油酸的相对含量；F1为反应一段时间后反应混合物中油酸的相对含量。

2 结果与讨论

2.1 T1脂肪酶催化甘油与油酸合成甘油酯过程油酸酯化率变化规律

搅拌转速和酶添加量分别固定为542 r／min和9.7 U／g底物，分别考察了水添加量、反应温度、甘油与油酸物质的量比对酯化率的影响，结果见图1。

图1 不同反应条件对T1脂肪酶促合成甘油酯过程中油酸酯化率的影响

从图1可知，随着水添加量增大，油酸酯化率呈现先增大后减小的趋势，说明了添加适量水有利于油酸向甘油酯的转化，但是当水添加量超过一定量时，则不利于反应朝着正反应方向进行；反应温度从40℃提高到60℃时，油酸酯化率呈现逐渐增大的趋势，当温度到70℃时，油酸酯化率急剧下降；随着甘油／油酸物质的量比的增大，油酸酯化率呈现一直增大的趋势。由图1分析可知，反应过程因素水添加量、反应温度、甘油／油酸物质的量比对油酸酯化率有不同程度的影响。

2.2 T1脂肪酶催化合成甘油酯过程中油酸变化动力学方程的建立

油酸（A）与甘油（B）在T1脂肪酶催化作用下合成甘油酯（C），如式（2）所示。在本试验中，甘油与油酸的物质的量比设置为2∶1～6∶1，在整个催化合成过程中，甘油的浓度相对于油酸的浓度始终是过量的，而且甘油浓度要大于甘油酯的浓度。因此，假设本反应中T1脂肪酶催化反应近似为单底物催化反应过程，假设其遵循一级反应动力学。根据反应动力学的基本原理，油酸酯化率方程表示为：

式中：Er为油酸的酯化率／%；CE为理论上反应达平衡状态下的油酸的最大酯化率／%；k为反应速率常数／h-1；t为反应时间／h。

从图1可知，在酶催化的初始阶段，尤其是在水添加量较少、反应温度较低、甘油／油酸物质的量比较小的情况下，酶活性的完全发挥需要一定的延迟时间，因此，引入一个新的时间参数——t0，代表T1脂肪酶催化过程中酶活性发挥所需要的延迟时间，对式（3）进行修正，更利于方程反映实际反应过程，因此，式（3）可改写为：

式（4）是T1脂肪酶催化合成甘油酯过程中油酸酯化率变化的动力学模型。

2.3 反应动力学方程计算值与试验值的比较与验证

通过考察图1不同反应条件下的油酸的酯化率的数据，并以此为基础，对不同反应条件的数据分别对式（4）进行规划拟合求解，求出各阶段对应的方程系数后，建立了各个反应阶段对应的反应动力学方程表达式，以探讨不同反应条件对合成甘油酯过程中反应速率和油酸酯化率的影响。

将相应的动力学系数代入式（4）后，计算得到油酸酯化率的系列理论计算值，并对油酸酯化率的实验值作图，其关系如图2所示。由图2可知，两者之间的线性相关系数为R2＝0.996，由此可知，依据动力学模型计算得到的油酸酯化率理论值与试验所测的酯化率实测值之间具有较好一致性，这说明了前面假设本反应近似等于一级反应动力学是合理的，该动力学模型的建立能较好反映本试验条件范围内T1脂肪酶催化甘油与油酸合成甘油酯反应过程中油酸酯化率的变化规律，表明了建立的动力学模型的可靠性。因此，需进一步探讨对各反应条件与动力学方程系数之间的关系。

图2 油酸酯化率的试验测定值与动力学模型计算值之间比较

2.4 反应条件对T1脂肪酶催化合成甘油酯过程油酸酯化率变化规律的分析

2.4.1 水添加量对油酸酯化率变化的影响规律

图3是水添加量对油酸酯化率变化影响规律示意图。由图3a可知，水添加量对酶催化合成甘油酯过程的反应速率常数k的影响较大；当水添加量为4%时，其反应速率常数k为0.195 7 h-1，k值随着水添加量增大而增大，但是当水添加量超过到一定数值（＞7%）后，k呈现下降趋势，这意味着为了获取合适的反应速率，水添加量要控制在合适范围之内。CE则随着水添加量增大呈现近似于线性下降的趋势（图3a）。这主要由于脂肪酶在反应初始阶段需要适量水分以保持其活性的三维结构状态，然而过多的水添加量及反应后期生成的水分影响热力学反应，同时限制了疏水性底物在酶分子附近的溶解性[10]。因此，在生产过程中，需要选择合理的水添加量，确保提高反应速率的同时通过抽真空或加分子筛的措施控制反应体系中水分，从而推动反应向正方向进行，提高反应底物的转化率。由图3b可知，当水分含量从4%提高到5%时，t0随着水添加量增大而增大，但是，水添加量增大到一定程度后（≥6%），t0呈现下降趋势，这说明使T1脂肪酶酶活充分发挥，需要考虑选择合适的水添加量。

图3 水添加量对酯化反应的影响

2.4.2 反应温度对油酸酯化率变化的影响规律

图4是反应温度对油酸酯化率变化影响规律示意图。由图4a可知，反应速率常数k随着温度的升高呈现先升高后降低的趋势，这说明反应温度对k值的影响较大。在较低反应温度下，酶催化的反应速率较慢；随着温度的升高，酶催化的反应速率逐渐增大，但当超过一定温度（＞60℃）后，k值呈现急剧下降趋势，这主要由于过高的温度造成了酶蛋白变性，酶活力下降，影响了酶催化反应速率。当温度从40℃增加至60℃，CE值从62.79%增加到68.05%；当温度增加到70℃时，CE值急剧下降到11.66%，这说明了在合适的范围（40～60℃），增加温度，有助于提高油酸转化为甘油酯，但是温度过高（70℃）容易影响酶活性，进而影响理论上平衡时油酸最大酯化率。由图4b可知，t0随着温度升高而呈现先增大后减小的趋势，这说明在加热过程中t0受到温度影响较大，当温度超过50℃时，t0下降得较快，说明了温度对t0的影响也比较明显，在T1脂肪酶应用过程中，需要综合考虑甘油酯得率与反应速率的整体需要而选择合适的反应温度。

图4 反应温度对酯化反应的影响

2.4.3 底物物质的量比对油酸酯化率变化的影响规律

图5 底物物质的量比对酯化反应的影响

图5是甘油／油酸物质的量比对油酸酯化率变化影响规律示意图。由图5a可知，反应速率常数k值随着底物物质的量比的增大而不断增大，这说明了增大甘油的量有助于提高T1脂肪酶催化反应速率。当甘油用量增大到一定程度后，k值的增大趋于平缓。由图5a可知，T1脂肪酶催化合成甘油酯过程的油酸最大酯化率与底物物质的量比密切相关。随着甘油用量的增大，反应朝着生成甘油酯的方向进行，使得平衡时底物的最大酯化率有所提高。因此，在T1酶催化反应过程中，为了获取合适的反应速率和平衡时油酸的最大酯化率，以及综合考虑底物的成本，需要选择合适的底物物质的量比使得该反应处于合理的控制范围。从图5b可知，t0随着底物物质的量比的增大呈现下降趋势，这说明了甘油用量的增大，有助于提高T1脂肪酶催化的反应的速率提高的同时，也有助于减少该过程抑制酶活发挥所需的加热时间。

3 结论

研究了水添加量、反应温度、底物物质的量比对T1脂肪酶催化合成甘油酯过程中油酸酯化率的影响。基于本试验的条件，得到了反应条件对油酸酯化率系列试验数据。同时，从反应的基本原理出发，推导并假设该反应遵循一级反应动力学。结合试验数据和推导的动力学方程，通过规划求解得到油酸酯化率动力学反应方程 Er＝CE×[1-e-k（t-t0）]的对应的方程系数值：反应速率常数k，理论上平衡时油酸最大酯化率CE，酶活发挥延迟时间t0。通过对比动力学方程计算得到的油酸酯化率理论值与油脂酯化率的实验测定值，两者的相关系数为0.996，验证了该反应过程是符合一级反应动力学方程，说明了该方程可较好反映该过程中油酸酯化率的变化规律。最后，将方程系数对反应影响因素作图，得到了反应条件对对应的动力学方程系数的影响程度各不相同，由这些数据可知，要得到合适的甘油酯得率、反应速率和利于T1脂肪酶酶活的发挥，就要结合试验数据选择合适的反应条件。

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