ChAT表达激活剂的筛选及其机制研究

董明勤，刘 飙，刘 燕，李文刚，李中秋

（1.吉林大学中日联谊医院，吉林长春130033；2.首都医科大学附属北京朝阳医院）

ChAT表达激活剂的筛选及其机制研究

董明勤1，刘 飙1，刘 燕1，李文刚1，李中秋2＊

（1.吉林大学中日联谊医院，吉林长春130033；2.首都医科大学附属北京朝阳医院）

目的利用ChAT启动子荧光素酶报告系统对中药小分子化合物进行筛选，以期找到能够促进ChAT表达的化合物。方法用构建的ChAT启动子荧光素酶报告体系从400余种中药小分子化合物中筛选ChAT启动子激活剂，并用RT－PCR和Western Blot方法对筛选得到的小分子化合物进行验证。利用免疫印迹法分析筛选得到的化合物对细胞内信号通路的影响。结果通过筛选发现大豆甙元能够激活ChAT启动子的活性，与对照相比具有显著性差异（P＜0.05）。进一步研究结果显示，大豆甙元也可以促进ChAT mRNA和蛋白的表达。另外，大豆甙元能够促进细胞内ERK的磷酸化，并进而激活ERK／MAPK信号通路。结论大豆甙元能够促进ChAT基因的表达，并引起细胞内ERK／MAPK信号通路的改变。

大豆甙元；药物筛选；ChAT；神经干细胞；ERK／MAPK信号通路

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1576）

乙酰胆碱（ACh）已被证明在中枢神经系统（CNS）调节着不同的生理功能，包括认知、注意力和觉醒等，在中枢神经系统中胆碱能神经元的机能失调也与年龄相关的记忆障碍、神经系统退行性疾病阿尔茨海默病（AD）的发病相关［1］。乙酰胆碱转移酶（ChAT）是胆碱能神经元递质乙酰胆碱合成的限速酶［2］。早期的观点认为，中枢神经系统无法进行自我更新和修复是因为中枢神经系统内不存在干细胞。直到Randon等学者提出神经干细胞的概念，他们从小鼠海马区域分离出可以增殖、分裂，并具有多项潜能的神经干细胞［3］。目前，神经干细胞的定向诱导分化研究已经成为生命科学领域中最引人注目的热点。随着神经干细胞研究的迅速发展，神经干细胞定向诱导分化和移植治疗神经损伤及退行性疾病也逐渐成为可能。那么，在体内外研究定向分化的机制、寻找治疗靶点、开发新的治疗药物，已成为现代医学和生物学研究的重点问题。鉴于ChAT是胆碱能神经的重要标志物，本研究以ChAT启动子为靶点，对小分子化合物库进行筛选，以期发现能够促进ChAT基因表达的小分子化合物。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂 DMEM购自GIBCO公司；胎牛血清购自美国Hyclone公司；Trizol购自Invitrogen公司；DEPC购自Sigma公司；逆转录及PCR试剂盒购自北京全式金公司；荧光素购自BD Monolight TM公司，ONPG购自上海生物工程公司；ERK1／2和p－ERK1／2的抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司；ChAT抗体购自Millipore公司；抗GAPDH抗体购自上海康成生物有限公司。

1.1.2 细胞与质粒 人胚胎肾细胞293T（HEK293T）及小鼠畸胎瘤细胞（P19）购自上海细胞研究所细胞库并由实验室传代培养。ChAT启动子荧光素酶报告质粒为本实验室构建。

1.2 试验方法

1.2.1 细胞培养 将P19细胞用含10%胎牛血清、100μg／ml链霉素、100μg／ml青霉素的DMEM培养基进行培养，置于37℃，5%CO2培养箱中。细胞传代时，用DMEM或D－Hanks缓冲液清洗细胞以除去培养基和血清，随后用0.25%的胰蛋白酶溶液（含有0.2%EDTA）消化细胞，在倒置显微镜下观察，当细胞形态发生变化时，用移液器将胰蛋白酶溶液小心地吸出，再加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，将细胞吹打至完全脱落，并按照一定比例进行传代。

1.2.2 细胞转染与荧光素酶活性检测 转染前一天将P19细胞以1×105／孔的比例接种到24孔细胞板中，使细胞在转染前长到80%左右；次日将ChAT启动子荧光素酶报告载体转染入P19细胞（步骤参见Invitrogen的LipofectamineTM2000）中，转染时为了减少误差，同时将pCMV－β－gal质粒共同转染。48h后取出细胞，弃去旧的培养基，每孔中加入100μl细胞裂解液，置于冰上30min。在96孔白板中加入5μl的Assay cocktail，再加入45μl细胞裂解液及100μl检测液，立即用荧光化学发光仪测定荧光素酶的活性；另取出20μl细胞裂解液置于酶标板中，加入β－半乳糖苷酶（β－gal）活性检测液50μl至液体变黄，通过酶标仪测定OD450值，并用此值来标化荧光素酶活性值，从而修正由于转染效率的差异而引起的误差。

1.2.3 化合物的筛选 利用ChAT启动子荧光素酶报告体系对本实验室中药库中400多种中药单体及中药有效组分进行初步筛选。用ChAT启动子荧光素酶报告载体转染细胞24h后，加入中药化合物（化合物终浓度为5μg／ml）继续培养8－12h后进行荧光素酶活性检测。

1.2.4 RNA提取与RT－PCR 将待提取RNA的细胞取出，用TRIzol法提取RNA（步骤参见Invitrogen产品说明），逆转录后进行PCR扩增（步骤参见北京全式金公司产品），将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。RT－PCR引物见表1。

1.2.5 蛋白质提取与Western Blot 将大豆甙元（终浓度为5μg／ml）处理24h的细胞取出，提取蛋白、SDS－PAGE电泳分离后转膜2h、封闭后用TBST漂洗，加入稀释相应浓度的第一抗体，4℃孵育过夜后多次漂洗，标记第二抗体。孵育1h后漂洗，显影分析。

表1 RT－PCR引物

2 结果

2.1 ChAT基因转录激活剂的筛选

用以ChAT启动子为靶点的筛选模型对400余种小分子化合物进行筛选，通过检测ChAT启动子驱动的荧光素酶的活性来判断化合物对ChAT启动子活性的影响。结果如图1所示，大豆甙元（daidzein）对ChAT启动子具有明显的激活作用，与对照相比在统计学上具有显著性差异（＊P＜0.05）。

图1 Daidzein对ChAT启动子活性的影响

2.2 Daidzein对ChAT mRNA和蛋白表达的影响

鉴于Daidzein具有激活ChAT启动子的作用。我们进一步通过RT－PCR和免疫印迹法检测了Daidzein对ChAT mRNA和蛋白表达的影响。结果如图2及3所示，Daidzein同样可以促进ChAT－mRNA和蛋白的表达。

图2 Daidzein对ChAT mRNA表达的影响

图3 Daidzein对ChAT蛋白表达的影响

2.3 Daidzein对细胞内信号通路的影响

为了研究Daidzein对细胞内的信号通路的影响，我们通过Western blot方法检测了Daidzein对ERK／MAPK信号通路的影响。结果如图4所示，Daidzein可促进ERK1／2的磷酸化，说明Daidzein可激活ERK／MAPK信号通路，提示Daidzein促进ChAT基因的表达可能与其激活ERK／MAPK信号有关。

图4 Western blot检测Daidzein对ERK／MAPK信号的影响

3 讨论

胆碱能神经元在中枢神经系统中发挥至关重要的作用，参与学习、记忆、睡眠等生理功能。中枢神经系统中胆碱能神经元的机能失调也与年龄相关的记忆障碍、神经系统退行性疾病阿尔茨海默病（AD）的发病相关［4］。自从Randon等分离出神经干细胞之后，神经再生的研究成为了生命科学领域的研究热点［1］。也使神经干细胞的移植及定向诱导分化成为可能。有学者研究发现，激活素和bFGF能够诱导神经干细胞定向分化为ChAT阳性细胞和TH阳性细胞［5］。但是激活素和bFGF均为细胞因子，成本较高，且容易失活，因此寻找更加低廉、稳定的神经分化诱导剂仍是生命科学领域的重点问题。鉴于ChAT是胆碱能神经的重要标志物，本研究以ChAT启动子为靶点建立筛选模型，对中药小分子化合物库中的化合物进行筛选，以期发现能够诱导干细胞向胆碱能神经进行分化的中药化合物。结果发现，Daidzein对ChAT基因的转录具有促进作用，此作用进一步通过RT－PCR和免疫印迹得到证实。

本研究应用的启动子水平筛选模型从基因表达调控出发，针对某一特定的靶点进行药物筛选，有更好的专一性、效率更高、筛选范围更广，避免了以往动物水平筛选和组织水平筛选的劣势。但是这仅仅是初步的研究，如何从细胞，分子水平的筛选过度到临床试验，还有很长的路要走［6］。

ERK／MAPK是与细胞增殖密切相关的通路，可通过促进某些基因表达，影响细胞的增殖及分化［7］。ERK是ras丝裂原信号转导途径下游的核心元件，ERK被激活后可进入核内，促进多种转录因子磷酸化，如ERK促进血清反应因子（SRF）磷酸化，并结合含有血清反应元件（SRE）的靶基因启动子，调节其转录活性［9］。本研究通过Western blot分析发现，中药化合物大豆甙元能够促进ERK的磷酸化，进而激活ERK／MAPK信号通路。提示Daidzein促进ChAT基因的表达可能与其激活ERK／MAPK信号有关，但尚需要进一步的实验去证明。本研究为进一步研制和开发胆碱能神经分化诱导剂奠定了实验基础。

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［4］Teipel S，Heinsen H.Cholinergic basal forebrain atrophy predicts amyloid burden in Alzheimer＇s disease［J］.Neurobiology of Aging，2014，35（3），482.

［5］Biao Liu，Yongli Bao，Yan Liu，et al..Effects of Activin A and bFGF on Induction of Neural Stem Cells into ChAT－Positive Cells［C］.First International Conference on Cellular Molecular Biology Biophysics and Bioengineering.2010，3：1.

［6］刘丽霞，王永成.神经干细胞转基因疗法与运动性脊髓损伤的治疗［J］.中国组织工程研究与临床康复，2011，15（27）：5115.

［7］Younes－Rapozo V，Felgueiras L，et al.A role for the MAPK／ERK pathway in oligodendroglial differentiation in vitro：stage specific effects on cell branching［J］.International journal of developmental Neuroscience，2009，27（8）：757.

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Screening of ChAT gene expression modulators from Small－molecule Compounds and study of the modulation mechanisms

DONG Ming－qin，LIU Biao，LIU Yan，et al.（China Japan Union Hospital of Jilin University，Changchun130033，China）

ObjectiveScreening of ChAT gene expression activator from traditional Chinese medicine compounds library.MethodsScreening of ChAT gene expression activator from over 400compounds by using ChAT gene promoter driven luciferase reporter system，then investigated the compound effect on the expression of ChAT mRNA and pretein by RT－PCR and western blot.The effect of compounds on intracellular signaling pathway was study by western blot.ResultsDaidzein was found that can promote the activity of ChAT promoter（P＜0.05），and further increase the ChAT expression in both mRNA and protein levels.In addition，Daidzein can promote ERK1／2phosphorylation and activite the ERK／MAPK signaling pathway.ConclusionDaidzein can promote the expression of ChAT gene，and activite the ERK／MAPK signaling pathway.

Daidzein；compound screening；ChAT；neural stem cells；ERK／MAPK signaling pathway

Q786

A

2014－01－11）

1007－4287（2014）10－1576－03

＊通讯作者